Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo
Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.
Abstract
Primäre Neuronenkultur ist eine wesentliche Technik auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Um tiefere mechanistische Einblicke in das Gehirn zu gewinnen, ist es wichtig, ein robustes In-vitro-Modell zu haben, das für verschiedene neurobiologische Studien genutzt werden kann. Obwohl primäre Neuronenkulturen (d.h. langfristige Hippocampuskulturen) Wissenschaftlern Modelle geliefert haben, stellt sie die Komplexität des Gehirnnetzwerks noch nicht vollständig dar. Im Gefolge dieser Einschränkungen ist ein neues Modell entstanden, das Neurosphären verwendet, die eine engere Ähnlichkeit mit dem Gehirngewebe aufweisen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Beschichtung von hohen und niedrigen Dichten gemischter kortikaler und hippocampaler Neuronen, die aus dem Embryo des embryonalen Tages 14-16 Sprague Dawley Ratten isoliert wurden. Dies ermöglicht die Erzeugung von Neurosphären und langfristige primäre Neuronenkultur als zwei unabhängige Plattformen, um weitere Studien durchzuführen. Dieser Prozess ist extrem einfach und kostengünstig, da er mehrere Schritte und Reagenzien minimiert, die bisher als wesentlich für die Neuronenkultur galten. Dies ist ein robustes Protokoll mit minimalen Anforderungen, das mit erreichbaren Ergebnissen durchgeführt und weiter für eine Vielzahl von Studien im Zusammenhang mit Neurowissenschaften verwendet werden kann.
Introduction
Das Gehirn ist eine komplizierte Schaltung von neuronalen und nicht-neuronalen Zellen. Seit Jahren versuchen Wissenschaftler, Einblicke in diese komplexe Maschinerie zu gewinnen. Dazu griffen Neurowissenschaftler zunächst zu verschiedenen transformierten nervenbasierten Zelllinien für Untersuchungen. Jedoch, die Unfähigkeit dieser klonalen Zelllinien starke synaptische Verbindungen und richtige Axone oder Dendriten haben wissenschaftliches Interesse an primären Neuronenkulturen verschoben1,2. Der aufregendste Aspekt der primären Neuronenkultur ist, dass es eine Gelegenheit schafft, lebende Neuronen zu beobachten und zu manipulieren3. Darüber hinaus ist es weniger komplex im Vergleich zu Neuronengewebe, was es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung der Funktion und des Transports von verschiedenen neuronalen Proteinen macht. In jüngster Zeit haben mehrere Entwicklungen in den Bereichen Mikroskopie, Genomik und Proteomik neue Möglichkeiten für Neurowissenschaftler geschaffen, Neuronenkulturen auszunutzen4.
Primäre Kulturen haben es Neurowissenschaftlern ermöglicht, die molekularen Mechanismen hinter der neuronalen Entwicklung zu erforschen, verschiedene neuronale Signalwege zu analysieren und ein kohärenteres Verständnis der Synapse zu entwickeln. Obwohl eine Reihe von Methoden Kulturen aus primären Neuronen berichtet haben (meist aus dem hippocampalen Ursprung5,6,7), ist ein einheitliches Protokoll mit einem chemisch definierten Medium, das eine langfristige Kultur von Neuronen ermöglicht, noch benötigt werden. Jedoch, Neuronen mit geringer Dichte plattiert werden am häufigsten beobachtet, die nicht langfristig überleben, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an trophischen Unterstützung 8, die von den benachbarten Neuronen und Gliazellen zur Verfügung gestellt wird. Einige Methoden haben sogar vorgeschlagen, die primären Neuronen mit Gliazellen zu kultivieren, wobei die Gliazellen als Feederschicht9verwendet werden. Jedoch, Gliazellen stellen eine Menge Probleme aufgrund ihrer Überwucherung, die manchmal das neuronale Wachstum überschreiben10. Unter Berücksichtigung der oben genannten Probleme ist daher ein einfacheres und kostengünstigeres primäres neuronales Kulturprotokoll erforderlich, das sowohl von Neurobiologen als auch von Neurochemikern für Untersuchungen verwendet werden kann.
Eine primäre Neuronenkultur ist im Wesentlichen eine Form der 2D-Kultur und stellt nicht die Plastizität, räumliche Integrität oder Heterogenität des Gehirns dar. Dies hat dazu geführt, dass ein glaubwürdigeres 3D-Modell namens Neurosphären11,12benötigt wird. Neurosphären stellen Neurowissenschaftlern eine neue Plattform dar, mit einer engeren Ähnlichkeit mit dem realen, in vivo Gehirn13. Neurosphären sind nicht anhaftende 3D-Cluster von Zellen, die reich an neuronalen Stammzellen (NSCs), neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), Neuronen und Astrozyten sind. Sie sind eine ausgezeichnete Quelle für die Isolierung von neuronalen Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen, die verwendet werden können, um Die Differenzierung in verschiedene neuronale und nicht-neuronale Linien zu untersuchen. Auch hier stellt die Variabilität innerhalb der Neurosphärenkulturen, die mit den zuvor gemeldeten Protokollen erzeugt werden, ein Hindernis für die Formulierung eines einheitlichen Neurosphärenkulturprotokolls14dar.
Dieses Manuskript stellt ein Protokoll dar, in dem es möglich ist, sowohl 2D- als auch 3D-Plattformen zu erzeugen, indem Zellverdichtungen aus einer gemischten kortikalen und hippocampalen Kultur abwechselnd werden. Es wird beobachtet, dass innerhalb von 7 Tagen frei schwebende Neurosphären aus hochdichten, plattierten Neuronen gewonnen werden, die aus dem E14-E16 Sprague Dawley Ratte Embryo isoliert sind, die nach weiterer Kultur Brücken und Verbindungen durch radiale glialartige Erweiterungen bilden. In ähnlicher Weise wird in den niedrigdichten, plattierten Neuronen eine primäre Neuronenkultur erhalten, die bis zu 30 Tage lang aufrechterhalten werden kann, indem das Pflegemedium zweimal pro Woche gewechselt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, dass durch die Änderung der Zellbeschichtungdichten von primären Neuronen zwei variable neuronale Plattformen erhalten werden. Obwohl dies eine einfache Methode ist, muss jeder Schritt sorgfältig ausgeführt werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Andere frühere Methoden haben entweder langfristige primäre Neuronenkulturen oder Neurosphärenkulturen berichtet. Die meisten primären NeuronenkulturProtokolle haben die Kultivierung von Hippocampus-Neuronen für 3-5 Wochen beteil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken CSIR-IICB Tieranlage. G. D. dankt ICMR, J. K. und V. G. danken DST Inspire und D. M. bei DBT, Indien für ihre Stipendien. S. G. würdigt SERB (EMR/2015/002230) Indien für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Referências
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