Поколение нейросфер из смешанных первичных гиппокампа и кортикальных нейронов изолированы от E14-E16 Sprague Даули Крыса эмбриона
Summary
Здесь представлен протокол для спонтанного поколения нейросфер, обогащенных в нервных клетках-прародителях из нейронов высокой плотности. Во время того же эксперимента, когда нейроны покрываются при более низкой плотности, протокол также приводит к длительным первичных культур нейронов крыс.
Abstract
Первичная культура нейронов является важным методом в области неврологии. Чтобы получить более глубокие механистические идеи в мозг, важно иметь надежную модель in vitro, которая может быть использована для различных исследований нейробиологии. Хотя первичные культуры нейронов (т.е. долгосрочные гиппокампа культур) предоставили ученым модели, он еще не представляет сложность сети мозга полностью. В результате этих ограничений, новая модель возникла с использованием нейросфер, которые имеют более близкое сходство с тканью мозга. Настоящий протокол описывает покрытие высокой и низкой плотности смешанных корковых и гиппокампальных нейронов, изолированных от эмбриона эмбрионального дня 14-16 Sprague Dawley крыс. Это позволяет для генерации нейросфер и долгосрочной первичной культуры нейронов в качестве двух независимых платформ для проведения дальнейших исследований. Этот процесс чрезвычайно прост и рентабельен, так как сводит к минимуму несколько шагов и реагентов, которые ранее считались необходимыми для культуры нейронов. Это надежный протокол с минимальными требованиями, которые могут быть выполнены с достижимыми результатами и далее использоваться для разнообразия исследований, связанных с неврологией.
Introduction
Мозг представляет собой сложную схему нейрональных и ненейрональных клеток. В течение многих лет ученые пытались получить представление об этом сложном механизме. Для этого нейробиологи первоначально прибегали к различным преобразованиям нервных клеточных линий для исследований. Тем не менее, неспособность этих клональных клеточных линий, чтобы сформировать сильные синаптические связи и надлежащие аксоны или дендриты сместили научный интерес к первичным культурам нейронов1,2. Наиболее захватывающим аспектом первичной культуры нейронов является то, что она создает возможность наблюдать и манипулировать живыми нейронами3. Кроме того, он менее сложен по сравнению с нервной тканью, что делает его идеальным кандидатом для изучения функции и транспортировки различных нейрональных белков. В последнее время несколько разработок в области микроскопии, геномики и протеомики создали новые возможности для нейробиологов, чтобы использовать нейронных культур4.
Первичные культуры позволили нейробиологам исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе нейронного развития, анализировать различные нервные сигнальные пути и развивать более последовательное понимание синапсиса. Хотя ряд методов сообщили культур из первичных нейронов (в основном из гиппокампа происхождения5,6,7), единый протокол с химически определенной среде, которая позволяет долгосрочной культуры нейронов по-прежнему необходимо. Тем не менее, нейроны покрытием при низкой плотности чаще всего наблюдаются, которые не выживают в долгосрочной перспективе, вероятно, из-за отсутствия трофической поддержки 8, которая обеспечивается соседних нейронов и глиальных клеток. Некоторые методы даже предложили совместного культивирования первичных нейронов с глиальными клетками,в которых глиальные клетки используются в качестве фидерного слоя 9. Тем не менее, глиальные клетки создают много проблем из-за их разрастания, которые иногда переопределить роста нейронов10. Таким образом, учитывая проблемы выше, более простой и экономичный протокол первичной нейронной культуры не требуется, который может быть использован как нейробиологов и нейрохимиков для исследований.
Первичная культура нейронов по существу является формой 2D-культуры и не представляет пластичность, пространственную целостность или неоднородность мозга. Это привело к необходимости более правдоподобной 3D-модели под названием нейросферы11,12. Нейросферы представляют новую платформу для нейробиологов, с более близким сходством с реальным, in vivo мозга13. Нейросферы являются неадекторными 3D-кластерами клеток, богатых нервными стволовыми клетками (НСК), нервными клетками-прародителями (НпК), нейронами и астроцитами. Они являются отличным источником для изоляции нервных стволовых клеток и нервных клеток-прародителей, которые могут быть использованы для изучения дифференциации в различные нейронные и ненейронные линии. Опять же, изменчивость в нейросферных культурах, производимых с использованием ранее сообщенных протоколов, представляет собой барьер для разработки единого протокола культуры нейросферы14.
Данная рукопись представляет собой протокол, в котором можно генерировать как 2D, так и 3D платформы путем чередования плотности клеточного покрытия от смешанной корковой и гиппокампальной культуры. Отмечается, что в течение 7 дней свободно плавающие нейросферы получаются из высокой плотности покрытых нейронов, изолированных от E14-E16 Sprague Dawley крысы эмбриона, которые на дальнейшее культуры, образуют мосты и взаимосвязи через радиальные глиально-подобные расширения. Аналогичным образом, в низкой плотности покрывало нейронов, первичной культуры нейронов, которые могут быть сохранены до 30 дней, получается путем изменения среднего обслуживания два раза в неделю.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает, что, изменяя плотность клеточного покрытия первичных нейронов, получаются две переменные нейронные платформы. Хотя это простой метод, каждый шаг должен быть тщательно выполнен для достижения желаемых результатов. Другие предыдущие методы либо сообщили долгос…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим животноводческий объект CSIR-IICB. Г.Д. благодарит ICMR, J. K. и V. G. thank DST Inspire, и D. M. благодарит DBT, Индия за их стипендии. S. G. любезно признает SERB (EMR/2015/002230) Индия для оказания финансовой поддержки.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Referências
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
