Purificação de plaquetas de sangue de rato

Resumo

Aqui, o sangue do rato foi coletado na presença de um anticoagulante. As plaquetas foram purificadas por meio de gradiente iohexol utilizando centrifugação de baixa velocidade. As plaquetas foram ativadas com trombina para investigar se eram viáveis. A qualidade das plaquetas purificadas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia.

Resumo

As plaquetas são purificadas de sangue total para estudar as suas propriedades funcionais, que devem estar livres de glóbulos vermelhos (RBC), glóbulos brancos (WBC) e proteínas plasmáticas. Nós descrevemos aqui a purificação das plaquetas do sangue do rato usando o meio do inclinação Three-Fold mais iohexol relativo ao volume e à centrifugação da amostra de sangue em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A recuperação/rendimento das plaquetas purificadas foi de 18,2-38,5%, e as plaquetas purificadas encontravam-se em estado de repouso, o que não continha nenhum número significativo de RBC e WBC. As plaquetas purificadas tratadas com trombina apresentaram até 93% de ativação, indicando sua viabilidade. Nós confirmamos que as plaqueta purified são suficientemente puras usando a avaliação cytometric e microscópica do fluxo. Estas plaquetas podem ser usadas para a expressão gênica, ativação, liberação de grânulos, agregação e ensaios de aderência. Este método pode ser usado para a purificação de plaquetas do sangue de outras espécies também.

Introdução

As plaquetas são um componente do sangue que funciona como um iniciador de coagulação do sangue em resposta a danos no vaso sanguíneo. Eles se reúnem no local da lesão para ligar a parede do vaso¹. As plaquetas são fragmentos de anucleato de citoplasma derivados dos megacariócitos da medula óssea a influência da Trombopoietina e entram na circulação². Eles são considerados metabolicamente ativos e capazes de detectar o ambiente extracelular ativando cascatas de sinalização intracelular que resultam em espalhamento de plaquetas, agregação e formação de plugue hemostático^1,3

Protocolo

A coleta de sangue do rato deve ser conduzida com o cuidado animal institucional apropriado e aprovação do Comitê do uso.

Nota: O protocolo de purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo na Figura 1.

1. coleta de sangue

1. Adicionar 25 μL de 3,2% de citrato de sódio (pH 7,2) como anticoagulante e 0,4 mM de Gly-pro-ARG-pro (GPRP) num tubo de polipropileno.
2. Colete aproximadamente 200 μL de sangue do mouse C57BL/6 usando sangramento retro-orbital.
   Nota: o sangue pode ser coletado de qualquer tipo de estirpe do rato in....

Resultados

O resumo da purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem a coleção do sangue do rato usando o sangramento retro-orbital na presença de um anticoagulante, adição da amostra de sangue no meio do inclinação do iohexol, centrifugação em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A qualidade das plaquetas purificadas foi avaliada com microscopia e citometria de fluxo após coloração com anticorpo para detecção de células .......

Discussão

Comumente, as plaquetas são isoladas por centrifugação de baixa velocidade que produz plasma rico em plaquetas que contém um número significativo de células sanguíneas, detritos celulares e proteínas plasmáticas que podem interferir com os ensaios e necessidades bioquímicas e fisiológicas purificação mais adicional²¹. Portanto, é importante usar um método rápido e simples que pode produzir plaquetas puras sem grandes contaminantes. O protocolo aqui apresentado descreve a purificação de plaquetas d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
APC rato anti-camundongo/humano CD62P (P-selectina)	Thermoscientific	17-0626-82 Marcador de	ativação de plaquetas
Tubo Eppendorf	Fisher Scientific	14-222-166	Tubo para centifuge
FACS DIVA software	BD Biosciences	Item não catalogado	Análise de plaquetas e
tubo FACS	Fisher Scientific	352008	Tubos para fluxo citomtério
Soro fetal bovino (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingrediente para tampão de coloração
FITC rato anti-camundongo CD41	BD Biosciences	553848	Marcador de plaquetas
Citômetro de fluxo	BD Biosciences	Item não catalogado	Análise de plaquetas e sangue total
Software FlowJo	FlowJo, Inc.	Item não catalogado	Análise de plaquetas e sangue total
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Previne a formação de coágulos plaquetários
Hematócrito Tubo capilar	Fisher Scientific	22-362566	Tubo capilar de coleta de sangue
Hemavet	Drew Scientific	Item não catalogado Analisador de	células sanguíneas
Hemocitômetro	Hausser Câmara de	contagem de células	3100
Isoflurano	Baxter	1001936040	Uso para anestesiar microscópio de camundongo
(Olympus CKX41)	Olympus	Item não catalogado	Monitoramento e contagem de células
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Gradiente médio
PE rato anti-rato CD45	BD Biosciences	561087	marcador WBC
PE-Cy7 rato anti-rato TER 119	BD Biosciences	557853	marcador RBC
Pontas de pipeta 200 µ L, de diâmetro largo	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferência de amostras de sangue e plaquetas
Pontas de pipeta 1000 µ L, furo largo	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferência de amostras de sangue e plaquetas
Fosfato buffured salino (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Tampão para lavagem e diluição
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653	Soro fisiológico
Citrato de sódio	Fisher Scientific	02-688-26	Anticoagulante
Tampão de coloração	Interno	Item não catalogado	Tampão de lavagem e diluição
Água estéril	Interno	Item não catalogado	Solvente
Centrífuga de mesa	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Centrífuga de rotor de balde oscilante
Trombina	Enzyme Research Laboratoty	HT 1002a	Agonista de ativação plaquetária
Tricina	Tampão Sigma-Aldrich	T0377	para meio Nycodenz

de sangue total Scientific