Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein
Summary
Vi karakteriserede en ny kinase protein ved hjælp af robuste biokemiske tilgange: Western blot analyse med et dedikeret specifikt antistof på forskellige cellelinjer og væv, interaktioner ved coimmunoprecipitation eksperimenter, kinaseaktivitet detekteret af vestlige Blot ved hjælp af et phospho-specifikt antistof og ved γ [32P] ATP-mærkning.
Abstract
Omfattende hele genomsekvensering har identificeret mange åbne læse rammer (Orf’er), der giver mange potentielle proteiner. Disse proteiner kan have vigtige roller for cellen og kan opklare nye cellulære processer. Blandt proteiner er kinaser store aktører, da de hører til celle signalering veje og har evnen til at tænde eller slukke mange processer afgørende for skæbnen for cellen, såsom cellevækst, division, differentiering, motilitet, og død.
I denne undersøgelse fokuserede vi på et nyt potentielt kinaseprotein, LIMK2-1. Vi demonstrerede sin eksistens af Western blot ved hjælp af et bestemt antistof. Vi evaluerede samspillet med et opstrømsregulerende protein ved hjælp af coimmunoprecipitation-eksperimenter. Coimmunoprecipitation er en meget kraftfuld teknik i stand til at detektere samspillet mellem to målproteiner. Det kan også bruges til at opdage nye partnere af en agn protein. Agn protein kan renses enten via et tag konstrueret til sin sekvens eller via et antistof specifikt rettet mod det. Disse protein komplekser kan derefter adskilles af SDS-PAGE (Natriumdodecyl sulfat Polyacrylamidgel) og identificeres ved hjælp af massespektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 blev også brugt til at teste sin kinase aktivitet in vitro af γ [32P] ATP mærkning. Denne veletablerede analyse kan bruge mange forskellige substrater, og muterede versioner af agn kan anvendes til at vurdere den rolle, specifikke rester. Virkningerne af farmakologiske agenser kan også evalueres, da denne teknik både er meget følsom og kvantitativ. Ikke desto mindre kræver håndtering af radioaktivitet særlig forsigtighed. Kinaseaktiviteten kan også vurderes med specifikke antistoffer rettet mod fosfo-gruppen af den modificerede aminosyre. Disse former for antistoffer er ikke kommercielt tilgængelige for alle fosfo modificerede rester.
Introduction
I mange årtier er talrige signalerings veje blevet belyst, og deres involvering i afgørende cellulære processer såsom celledeling, differentiering, motilitet, programmeret celledød, immunitet og Neurobiologi, er blevet vist. Kinaser spiller en væsentlig rolle i disse signalerings veje, da de ofte finregulerer deres aktivering eller inaktivering og er en del af forbigående alsidige komplekser, der reagerer på eksterne stimuli1,2,3. Mutation og dysregulering af kinaser ofte fører til sygdomme hos mennesker, og de er derfor blevet et af de vigtigste Drug mål i løbet af de seneste 40 år4.
I denne sammenhæng er det vigtigt at kunne påvise kinase interaktion med deres upstream regulerende myndigheder eller downstream-substrater og at identificere nye partnere. Affinity rensning og immunopræcipitation er meget kraftfulde teknikker til isolering af protein komplekser5. Agn protein eller kinase kan mærkes med en specifik peptid sekvens tillader brug af kommercielle perler kovalent kombineret med antistoffer rettet mod peptid. Dette materiale muliggør en høj reproducerbarhed i forsøg6,7,8. Endogene proteiner kan også være immunoprecipitated ved hjælp af antistoffer rettet direkte agn protein. Antistofferne kan være kryds forbundne med protein A eller protein G agopstået perler eller blot inkuperet med disse perler før tilsætning af lysatet. Lysis buffere skal optimeres for at tillade protein solubilisering uden at miste interaktion og for at undgå proteinnedbrydning. En væsentlig ulempe ved denne fremgangsmåde er, at interaktionen opdages ved celle lysis; Derfor kan forbigående eller svage interaktioner sammen med dem, der kræver subcellulær kontekst, gå glip af. Andre teknikker kan anvendes til at arbejde direkte i cellen såsom nærheds ligation assay (PLA)9, in vivo Cross-Linking-assisteret Affinity rensning (xap)10, bioluminescens resonans energi Transfer (BRET) eller Förster resonans energi Transfer (fret)11,12. Desuden er immunopcipitation ikke egnet til at bestemme de termodynamiske konstanter for bindingen, for hvilke der kræves fysiske teknikker såsom overflade Plasmon resonans, isotermisk titrering Calorimetri eller Microscale Thermophorese 13,14.
Kinaseaktiviteten kan vurderes ved hjælp af flere teknikker. Heri fokuserede vi på fosho-specifikke antistoffer og in vitro γ [32P] ATP (adenosin TriPhosphate) mærkning. Phospho-specifikke antistoffer er rettet mod fosfat modifikationen af en bestemt rest i et protein. De kan anvendes i Western blot eller ELISA (enzym-linked ImmunoSorbent assay) efter celle lysis, til Immunohistokemi, og også på intakte celler ved hjælp af flow cytometri eller immunofluorescens. Deres ulemper kan omfatte deres manglende specificitet, som kan evalueres ved hjælp af en muteret version af målproteinet, og deres ikke er kommercielt tilgængelige for alle proteiner. In vitro γ [32P] ATP mærkning er en meget robust, veletableret og meget følsom metode15. Immunoprecipiterede eller rekombinante proteiner kan anvendes, og forskellige substrater kan testes. Virkningerne af narkotika kan også vurderes som denne metode er kvantitativ. Dens største ulempe er, at radioaktiviteten i forbindelse med tilgangen kræver håndtering med forsigtighed. Alternative metoder er også mulige baseret på måling af fluorescerende eller luminescerende peptidsubstrater og drage fordel af ændrede fluorescerende/luminescerende egenskaber ved fosforylering. Sådanne metoder giver også mulighed for høj gennemløb, som er nødvendig, for eksempel i screening af molekyler, der kan være potentielle hæmmere af målkinase. Kinaser udgør faktisk en af de største grupper af narkotika-mål, der forfølges af medicinalvirksomhederne16.
I denne undersøgelse fokuserede vi på LIMK2-protein (LIMK2-1 står for Lin11, Isle1, Mec3 kinase isoformen 2-1). LIMK2 kinaseproteinet blev først beskrevet i 199517. Tre isoformer af LIMK2 er produceret af alternative splejsning: LIMK2a, LIMK2b og LIMK2-1. På nuværende tidspunkt er LIMK2-1 kun blevet beskrevet på mRNA-niveau i en enkelt undersøgelse18. Heri, vi karakteriserer dette potentielle nye kinase protein på det molekylære niveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange. For det første viser vi, at LIMK2-1 faktisk er syntetiseret. I lighed med de to modparter, LIMK2a og LIMK2b, interagerer det med upstream kinase ROCK (Rho-associeret protein kinase). Vi viser LIMK2-1 har en kinase aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men ikke på cofilin, det kanoniske substrat af LIM kinaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri har vi brugt robuste biokemiske værktøjer til at karakterisere på molekylært niveau et nyt protein, LIMK2-1, menes at være en kinase baseret på dens sekvens og på dens homologs, LIMK2a og LIMK2b20.
For det første demonstrerede vi eksistensen af LIMK2-1 på Proteinniveau ved hjælp af Western blot analyse med et bestemt antistof. Efter dette, vi evalueret sin interaktion med upstream kinase ROCK1, som er kendt for at regulere LIMK2a og LIMK2b, homologer af L…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af La Ligue contre Le cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen og La Région Centre Val de Loire. Mange tak til Aurélie Cosson og Déborah Casas for flow cytometri data, og til Keyron Hickman-Lewis for grundig korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
Referências
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neurociência. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
