Summary

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Published: June 30, 2019
doi:

Summary

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

Abstract

רצף הגנום השלם נרחב זיהה מסגרות קריאה פתוחות רבות (ORFs) מתן חלבונים פוטנציאליים רבים. חלבונים אלה עשויים להיות תפקידים חשובים לתא ועלול לפענח תהליכים סלולריים חדשים. בין החלבונים, קינסים הם שחקנים גדולים כפי שהם שייכים לתא איתות מסלולים ויש להם את היכולת לעבור או לבטל תהליכים רבים חיוניים לגורל התא, כגון צמיחת תאים, חלוקה, בידול, תנועתיות, ומוות.

במחקר זה התמקדנו בחלבון קינאז חדש, LIMK2-1. הדגמנו את קיומו על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדן ספציפי. הערכנו את האינטראקציה שלה עם חלבון במעלה הזרם באמצעות ניסויים coimmunoprecipitation. Coimmunoprecipitation היא טכניקה רבת עוצמה מסוגל לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים היעד. זה יכול לשמש גם כדי לזהות שותפים חדשים של חלבון פיתיון. ניתן לטהר את חלבון הפיתיון באמצעות תגית המיועדת לרצף שלו או באמצעות נוגדן המכוון אותו במפורש. מכלולי חלבון אלה עשויים להיות מופרדים על-ידי SDS-PAGE (נתרן Dodecyl סולפט PolyAcrylamide ג’ל) ומזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. Immunoprecipitated LIMK2-1 שימש גם כדי לבחון את פעילותה קינאז בתוך מבחנה על ידי γ [32P] ATP תיוג. שיטת מבוסס-היטב זו עשויה להשתמש במספר רב של מצעים שונים, וניתן להשתמש בגרסאות מוטציה של הפיתיון כדי להעריך את התפקיד של שאריות מסוימים. ההשפעות של סוכני תרופתי עשוי גם להיות מוערך מאז טכניקה זו הן רגישות מאוד כמותית. למרות זאת, הטיפול ברדיואקטיביות. דורש זהירות מיוחדת פעילות קינאז עשויה גם להיות מוערך עם נוגדנים ספציפיים מיקוד קבוצת פוספהו של חומצת האמינו ששונתה. סוגים אלה של נוגדנים אינם זמינים מסחרית עבור כל שאריות פוספהו שונה.

Introduction

במשך עשורים רבים, מסלולי איתות רבים כבר הובהר ואת מעורבותם בתהליכים סלולריים מכריע כגון חלוקת תאים, בידול, תנועתיות, מוות תאים מתוכנת, חסינות ונוירוביולוגיה, הוכח. קינסים לשחק תפקיד משמעותי אלה מסלולים איתות כפי שהם לעתים קרובות מווסת את ההפעלה שלהם או איון פעלה הם חלק מתחמי רב-תכליתי ארעי כי להגיב גירויים חיצוניים1,2,3. מוטציה ודיסרגולציה של קינסים לעיתים קרובות להוביל מחלות בבני אדם, ולכן הם הפכו לאחד מטרות הסמים החשובים ביותר במהלך 40 השנים האחרונות4.

בהקשר זה, חשוב להיות מסוגל לזהות את האינטראקציה של קינאז עם הרגולטורים שלהם במעלה הזרם או מצעים במורד ולזהות שותפים חדשים. טיהור וimmunoprecipitation אהדה הם טכניקות רבות עוצמה לבידוד של מכלולי חלבונים5. חלבון הפיתיון או קינאז עשוי להיות מתויג עם רצף פפטיד מסוים המאפשר שימוש בחרוזים מסחריים בשילוב עם נוגדנים מיקוד הפפטיד. החומר הזה מאפשר הזיית הגדול בניסויים6,7,8. חלבונים אנדוגני עשויים גם להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדנים מיקוד ישירות החלבון פיתיון. הנוגדנים יכול להיות מקושרת מקושרת חלבון A או חלבון G agarose חרוזים או פשוט מודבטים עם חרוזים אלה לפני הוספת lysate. מאגרי לליזה חייב להיות ממוטב כדי לאפשר מסיסות חלבונים מבלי לאבד אינטראקציה כדי למנוע השפלה חלבון. החיסרון העיקרי של גישה זו הוא כי האינטראקציה מזוהה על הליזה תאים; לפיכך, אינטראקציות זמניות או חלשות, יחד עם אלה הדורשות הקשר משנה-תאית עלול להיות חסר. טכניקות אחרות עשויות לשמש לעבודה ישירות בתא כגון שיטת הסמיכות הקרבה (PLA)9, ב vivo חוצה קישור-בסיוע לטיהור אהדה (xap)10, ביולומיאנמינציה העברת אנרגיה העברה (ברט) או Förster אנרגיית התהודה העברה (סריג)11,12. יתרה מזאת, הimmunoprecipitation אינו מתאים לקבוע את הקבועים התרמודינמיים של הכריכה, שעליהם טכניקות פיזיות כגון משטח תהודה במשטח, איזותרמי טיטור קלורימטריה או תרמופלאזיס מיקרוסקאלה . 13,14.

פעילות קינאז עשויה להיות מוערך באמצעות טכניקות מרובות. בזאת, אנו התמקדו נוגדנים ספציפיים פוספאו γ [32P] ATP (אדנוזין triphosphate) תיוג. הנוגדנים הספציפיים של פואהו מכוונים לשינוי פוספט של שאריות מסוימים בתוך חלבון. ניתן להשתמש בהם באבן החשופה המערבית או באליסה (השיטה החיסונית המקושרת באמצעות אנזימים) לאחר פירוק תאים, עבור אימונוהיסטוכימיה, וגם על תאים שלמים באמצעות הזרמת cy, או immunofluorescence. החסרונות שלהם עשויים לכלול חוסר ספציפיות, אשר ניתן להעריך באמצעות גרסה מוטציה של חלבון היעד, ושלהם לא להיות זמין מסחרית עבור כל החלבונים. בשנת החוץ γ [32P] תיוג ATP היא חזקה מאוד, שיטה מבוססת היטב ורגישה מאוד15. חלבונים Immunoprecipitated או רקומביננטי ניתן להשתמש, ומצעים שונים עשויים להיבדק. ההשפעות של תרופות ניתן גם להעריך כמו שיטה זו היא כמותית. החיסרון העיקרי שלה הוא כי הרדיואקטיביות הקשורה הגישה דורשת טיפול בזהירות. שיטות חלופיות אפשריות גם על בסיס מדידה של מצעים הפלורסצנט או של פפטיד ומנצלים את המאפיינים של פלורסנט משתנה/זורח על זירחון. שיטות כאלה גם לאפשר תפוקה גבוהה, אשר נדרש, למשל, בהקרנה של מולקולות שעלולות להיות מעכבי פוטנציאליים של קינאז היעד. אכן, הקינסים מייצגים את אחד השיעורים הגדולים ביותר של מטרות הסמים שנרדף על ידי חברות התרופות16.

במחקר זה, אנו מתמקדים LIMK2-1 חלבון (LIMK2-1 מייצג Lin11, Isle1, Mec3 קינאז isoform 2-1). חלבון LIMK2 קינאז תואר לראשונה ב-199517. שלושה איזוצורות של LIMK2 מיוצרים על ידי שחבור חלופיים: LIMK2a, LIMK2b ו LIMK2 -1. כיום, LIMK2-1 תוארה רק ברמת mRNA במחקר אחד18. להלן, אנו מגדירים את החלבון החדש הזה של קינאז ברמה המולקולרית, תוך שימוש בגישות ביוכימיות חזקות. ראשית, אנו להדגים כי LIMK2-1 אכן מסונתז. בדומה לשני עמיתיהם, LIMK2a ו-LIMK2b, היא מקיימת אינטראקציה עם ROCK קינאז במעלה (Rho-חלבון קינאז). אנו מראים LIMK2-1 יש פעילות קינאז על חלבון המיאלין Basic (MBP), אבל לא על קופפלין, המצע קאנוני של LIM.

Protocol

1. הכנה לתא לתרגום מעגל התראה: יש לבצע את כל השלבים של תרבות התא במעבדה ייעודית, והתאים מניפולציות בתוך ארון מיקרוביולוגי של Class 2. זרע HEK-293 (האדם כליה עובריים) תאים ב-Ø 10 ס מ לוחות ב 10 מ ל של DMEM (מדיום הנשרים שונה של Dulbecco) שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי. תרבות עבור 3 עד 5 ימים מתחת 5%…

Representative Results

חלבון LIMK2-1 הוא מסונתזLIMK2-1 מוזכר מאגר נתונים, אבל עד כה רק נייר אחד הראה את קיומו של mRNA שלה18. לעומת שלה שני הומויומנים שלה, LIMK2a ו LIMK2b, LIMK2-1 יש מתחם C-terminal נוסף המזוהה כמו חלבון פוספספטאז 1 תחום מעכבות (PP1i). עיצבנו נוגדן המטרה פפטיד של תחום זה, חומצות אמינו…

Discussion

כאן, השתמשנו בכלים ביוכימיים חזקים כדי לאפיין ברמה המולקולרית חלבון חדש, LIMK2-1, האמינו להיות קינאז מבוסס על הרצף שלה ועל יומני ההומויום שלה, LIMK2a ו LIMK2b20.

ראשית, הדגמנו את קיומו של LIMK2-1 ברמת החלבון באמצעות ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי. בעקבות זאת, הערכנו את ה…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי La ligue דשנה סרטן, l ‘ האגודה נוירופיבאטוטוסס ורקלינגהאוזן, ואת מרכז העיר וואל דה לואר. תודות לAurélie קסון ולדבוראה קסס לגבי מידע מעמיק של כתבי היד ולקיירון היקמן-לואיס.

Materials

Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for g[32P] labeling
g[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for g[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
b-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
b-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for g[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for g[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

Referências

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neurociência. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

View Video