Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein
Summary
Vi preget et nytt kinase protein ved hjelp av robuste biokjemiske tilnærminger: Western Blot analyse med et dedikert spesifikt antistoff på ulike cellelinjer og vev, interaksjoner av coimmunoprecipitation eksperimenter, kinase aktivitet oppdages av vestlig Blot bruke et fosfat-spesifikt antistoff og ved γ [32P] ATP merking.
Abstract
Omfattende hele Genova sekvensering har identifisert mange Open Reading rammer (ORFs) gir mange potensielle proteiner. Disse proteinene kan ha viktige roller for cellen og kan løse nye cellulære prosesser. Blant proteiner, kinaser er store aktører som de tilhører celle signalering trasé og har evnen til å slå på eller av mange prosesser avgjørende for skjebnen til cellen, for eksempel cellevekst, divisjon, differensiering, motilitet og død.
I denne studien, fokuserte vi på en ny potensiell kinase protein, LIMK2-1. Vi demonstrerte dens eksistens ved Western Blot ved hjelp av et spesifikt antistoff. Vi evaluerte sin interaksjon med en oppstrøms regulere protein ved hjelp coimmunoprecipitation eksperimenter. Coimmunoprecipitation er en meget kraftfull teknikk i stand til å oppdage samspillet mellom to mål proteiner. Det kan også brukes til å oppdage nye partnere av et agn protein. Agn proteinet kan bli renset enten via en tag konstruert til sin sekvens eller via et antistoff spesielt rettet mot det. Disse protein komplekser kan da skilles med SDS-side (Sodium Natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel) og identifisert ved hjelp av masse massespektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 ble også brukt til å teste sin kinase aktivitet in vitro av γ [32P] ATP merking. Denne veletablerte analysen kan bruke mange forskjellige underlag, og mutert versjoner av agnet kan brukes til å vurdere rollen til bestemte rester. Effekten av farmakologiske midler kan også evalueres siden denne teknikken er både svært følsom og kvantitativ. Likevel krever radioaktivitet særlig forsiktighet. Kinase aktivitet kan også vurderes med spesifikke antistoffer rettet mot fosfat gruppen av modifisert aminosyre. Slike antistoffer er ikke kommersielt tilgjengelige for alle fosfat modifiserte rester.
Introduction
For mangetiår, har mange signalering trasé vært belyst og deres engasjement i avgjørende cellulære prosesser som celledeling, differensiering, motilitet, programmert celle død, immunitet og nevrobiologi, har blitt vist. Kinaser spille en betydelig rolle i disse signalnettverk trasé som de ofte fint regulere deres aktivisering eller inaktive og er en del av transient allsidige komplekser som reagerer på eksterne stimuli1,2,3. Mutasjon og feilregulering av kinaser ofte føre til sykdommer hos mennesker, og de har derfor blitt en av de viktigste stoffet mål de siste 40 år4.
I denne sammenhengen er det viktig å være i stand til å oppdage kinase interaksjon med oppstrøms regulatorer eller nedstrøms underlag og for å identifisere nye partnere. Affinitet rensing og immunutfelling er svært kraftige teknikker for isolering av protein komplekser5. Agnet protein eller kinase kan være merket med en bestemt peptid sekvens tillater bruk av kommersielle perler covalently kombinert med antistoffer rettet mot peptid. Dette materialet tillater høy reproduserbarhet i eksperimenter6,7,8. Endogene proteiner kan også være immunoprecipitated ved hjelp av antistoffer rettet mot direkte agn protein. Antistoffene kan være tverrbundet til protein A eller protein G agarose perler eller bare inkubert med disse perlene før du legger lysat. Lyse Rings buffere må optimaliseres for å tillate protein oppløseliggjøringen uten å miste interaksjon og for å unngå protein degradering. En stor ulempe med denne tilnærmingen er at interaksjonen oppdages ved cellelyse; Derfor kan forbigående eller svake interaksjoner, sammen med de som krever subcellulære kontekst, bli oversett. Andre teknikker kan brukes til å arbeide direkte i cellen som nærhet ligation analysen (PLA)9, in vivo Cross-Linking-assistert affinitet rensing (XAP)10, bioluminesens RESONANS Energy Transfer (BRET) eller Förster resonans Energy Overføring (bånd)11,12. Videre er immunutfelling ikke hensiktsmessig å bestemme termodynamisk konstantene av bindingen, for hvilke fysiske teknikker som Surface Plasmon resonans, isotermiske titrering Reaksjonskalorimetri eller Mikroskala Thermophoresis er nødvendig 13,14.
Kinase aktivitet kan vurderes ved hjelp av flere teknikker. Heri, fokuserte vi på fosfat-spesifikke antistoffer og in vitro γ [32P] ATP (adenosin trifosfat) merking. Fosfat-spesifikke antistoffer rettet mot fosfat modifikasjon av en bestemt rest i et protein. De kan brukes i Western Blot eller ELISA (enzym-knyttet Immunosorbentanalyse analysen) etter cellelyse, for immunhistokjemi, og også på intakte celler ved hjelp av Flow flowcytometri eller immunofluorescence. Deres ulemper kan omfatte deres mangel på spesifisitet, som kan evalueres ved hjelp av en mutert versjon av målet protein, og deres ikke er kommersielt tilgjengelig for alle proteiner. In vitro γ [32P] ATP merking er en meget robust, veletablert og svært følsom metode15. Immunoprecipitated eller rekombinant proteiner kan brukes, og ulike underlag kan testes. Virkningene av rusmidler kan også bli vurdert som denne metoden er kvantitativ. Dens store ulempen er at radioaktiviteten knyttet til tilnærmingen krever håndtering med forsiktighet. Alternative metoder er også mulig basert på måling av fluorescerende eller selvlysende peptid underlag og dra nytte av endrede fluorescerende/selvlysende egenskaper ved fosforylering. Slike metoder tillater også høy gjennomstrømming, som er nødvendig, for eksempel i screening av molekyler som kan være potensielle hemmere av målet kinase. Faktisk, kinaser representerer en av de største klassene av narkotika mål forfulgt av farmasøytiske selskaper16.
I denne studien, fokuserte vi på LIMK2-1 protein (LIMK2-1 står for Lin11, Isle1, Mec3 kinase isoformen 2-1). Den LIMK2 kinase protein ble først beskrevet i 199517. Tre isoformene av LIMK2 er produsert av alternative skjøting: LIMK2a, LIMK2b og LIMK2-1. I dag har LIMK2-1 bare blitt beskrevet på mRNA nivå i en enkelt studie18. Heri, karakteriserer vi dette potensialet nye kinase protein på molekylnivå ved hjelp av robuste biokjemiske tilnærminger. For det første viser vi at LIMK2-1 er faktisk syntetisert. I likhet med sine to kolleger, LIMK2a og LIMK2b, samhandler den med oppstrøms kinase ROCK (Rho-assosiert protein kinase). Vi viser LIMK2-1 har en kinase aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men ikke på cofilin, det kanoniske underlaget av LIM-kinaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri har vi brukt robuste biokjemiske verktøy for å karakterisere på molekylnivå et nytt protein, LIMK2-1, antas å være en kinase basert på sekvensen og på sin homologs, LIMK2a og LIMK2b20.
For det første viste vi eksistensen av LIMK2-1 på protein nivået ved hjelp av Western Blot-analyse med et spesifikt antistoff. Etter dette evaluerte vi sin interaksjon med oppstrøms kinase ROCK1, som er kjent for å regulere LIMK2a og LIMK2b, homologs av LIMK2-1. Til slut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av La Ligue contre Le Cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, og la Région Centre Val de Loire. Mange takk til Aurélie Cosson og Déborah Casas for flyt flowcytometri data, og til Keyron Hickman-Lewis for grundig korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
Referências
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neurociência. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
