Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein
Summary
Vi karakteriserade ett nytt Kinas protein med hjälp av robusta biokemiska metoder: Western blot analys med en dedikerad specifik anti kropp på olika cellinjer och vävnader, interaktioner genom coimmunoprecipiten experiment, Kinas aktivitet detekteras av västerländska Blot med hjälp av en phospho-specifik anti kropp och γ [32P] ATP märkning.
Abstract
Omfattande sekvensering av hela genomet har identifierat många öppna Läs ramar (ORFs) som ger många potentiella proteiner. Dessa proteiner kan ha viktiga roller för cellen och kan nysta upp nya cellulära processer. Bland proteiner, kinaser är stora aktörer som de tillhör cell signalering vägar och har förmågan att slå på eller av många processer som är avgörande för ödet för cellen, såsom cell tillväxt, uppdelning, differentiering, motilitet, och död.
I denna studie fokuserade vi på ett nytt potentiellt Kinas protein, LIMK2-1. Vi visade dess existens genom Western blot med hjälp av en specifik anti kropp. Vi utvärderade dess interaktion med ett uppströms reglerande protein med hjälp av coimmunoprecipitionexperiment. Coimmunonederbörd är en mycket kraftfull teknik som kan detektera samspelet mellan två mål proteiner. Det kan också användas för att upptäcka nya partners av ett bete protein. Bete proteinet kan renas antingen via en tagg konstruerad till dess sekvens eller via en anti kropp som specifikt riktar sig mot den. Dessa protein komplex kan sedan separeras av SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel) och identifieras med hjälp av masspektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 användes också för att testa dess Kinas aktivitet in vitro-av γ [32P] ATP märkning. Denna väletablerade analys kan använda många olika substrat, och muterade versioner av betet kan användas för att bedöma den roll som specifika rester. Effekterna av farmakologiska agens kan också utvärderas eftersom denna teknik är både mycket känslig och kvantitativ. Radio aktivitets hanteringen kräver dock särskild försiktighet. Kinas aktivitet kan också bedömas med specifika anti kroppar riktade mot fosfogruppen av den modifierade aminosyran. Dessa typer av anti kroppar är inte kommersiellt tillgängliga för alla fosfimodifierade rester.
Introduction
Under många decennier har många signal vägar klarlagts och deras medverkan i viktiga cellulära processer såsom cell delning, differentiering, motilitet, programmerad celldöd, immunitet och neurobiologi, har visats. Kinases spelar en viktig roll i dessa signal vägar eftersom de ofta fint reglerar deras aktivering eller inaktive ring och är en del av övergående mångsidiga komplex som reagerar på yttre stimuli1,2,3. Mutation och Dysreglering av kinaser leder ofta till sjukdomar hos människor, och de har därför blivit en av de viktigaste drogen mål under de senaste 40 år4.
I detta sammanhang är det viktigt att kunna upptäcka Kinas interaktion med deras uppströms regulatorer eller nedströms substrat och att identifiera nya partners. Affinitet rening och immunutfällning är mycket kraftfulla tekniker för isolering av protein komplex5. Betet protein eller Kinas kan märkas med en specifik peptid sekvens gör det möjligt att använda kommersiella pärlor kovalent kombination med anti kroppar inriktade på peptiden. Detta material möjliggör en hög reproducerbarhet i experiment6,7,8. Endogena proteiner kan även vara immunutfällda med anti kroppar riktade direkt mot bete proteinet. Anti kropparna kan vara tvär bunden till protein A eller protein G AGA ros pärlor eller helt enkelt inkuberas med dessa pärlor innan du lägger lysate. Lysbuffertar måste optimeras för att möjliggöra proteinlösbilisering utan att förlora interaktion och för att undvika protein nedbrytning. En stor nackdel med detta tillvägagångs sätt är att interaktionen upptäcks vid celllys; Därför kan övergående eller svaga interaktioner, tillsammans med de som kräver subcellulär kontext, missas. Andra tekniker kan användas för att arbeta direkt i cellen som närhet ligation assay (PLA)9, in vivo tvär bindning-assisterad affinitet rening (XAP)10, bioluminescence resonans energi överföring (Bret) eller Förster resonans energi Överföring (fret)11,12. Dessutom är immunutfällning inte lämplig för bestämning av de termodynamiska konstanterna hos bindningen, för vilka fysikaliska tekniker såsom Ytplasmon-resonans, Isotermisk titrering Calorimetri eller Microscale Thermophoresis krävs 13,14.
Kinas aktivitet kan bedömas med hjälp av flera tekniker. Häri fokuserade vi på fosfospecifika anti kroppar och in vitro γ [32P] ATP (adenosintrifosfat) märkning. Fosfospecifika anti kroppar inriktar sig på fosfatmodifiering av en viss rest i ett protein. De kan användas i Western blot eller ELISA (enzymkopplad ImmunoSorbent assay) efter cell lysis, för immunhistokemi, och även på intakta celler med flödescytometri eller immunofluorescens. Deras nack delar kan omfatta deras brist på specificitet, som kan utvärderas med hjälp av en muterad version av mål proteinet, och att de inte är kommersiellt tillgängliga för alla proteiner. In vitro γ [32P] ATP märkning är en mycket robust, väletablerad och mycket känslig metod15. Immunoprecipiterade eller rekombinanta proteiner kan användas, och olika substrat kan testas. Effekterna av droger kan också bedömas eftersom denna metod är kvantitativ. Dess största nackdel är att radio aktiviteten i samband med metoden kräver hantering med försiktighet. Alternativa metoder är också möjligt baserat på mätning av fluorescerande eller självlysande peptid substrat och dra nytta av förändrade fluorescerande/självlysande egenskaper vid fosforylering. Sådana metoder möjliggör också hög genom strömning, vilket krävs, till exempel vid screening av molekyler som kan vara potentiella hämmare av mål Kinas. Faktum är att kinaser utgör en av de största klasserna av narkotika mål som eftersträvas av läkemedels företag16.
I denna studie fokuserade vi på LIMK2-1-proteinet (LIMK2-1 står för Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). LIMK2 Kinas protein beskrevs först i 1995-17. Tre ISO former av LIMK2 framställs genom alternativ skarvning: LIMK2a, LIMK2b och LIMK2-1. För närvarande har LIMK2-1 endast beskrivits på mRNA-nivå i en enda studie18. Häri karakteriserar vi detta potentiella nya Kinas protein på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder. För det första visar vi att LIMK2-1 är verkligen syntetiseras. Liknar dess två motsvarigheter, LIMK2a och LIMK2b, det interagerar med uppströms Kinas ROCK (Rho-associerade protein Kinas). Vi visar LIMK2-1 har en Kinas aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men inte på cofilin, den kanoniska substrat av LIM kinaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri har vi använt robusta biokemiska verktyg för att karakterisera på molekylär nivå ett nytt protein, LIMK2-1, tros vara en Kinas baserat på dess sekvens och på dess homologs, LIMK2a och LIMK2b20.
För det första demonstrerade vi förekomsten av LIMK2-1 på protein nivå med hjälp av Western blot-analys med en specifik anti kropp. Efter detta utvärderade vi dess interaktion med uppströms Kinas ROCK1, som är känd för att reglera LIMK2a och LIMK2b, homolo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av La Ligue contre le cancer, L’ Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, och la Région Centre Val de Loire. Ett stort tack till Aurélie Cosson och Déborah Casas för flödescytometri data, och till Keyron Hickman-Lewis för grundlig korrektur läsning av manuskriptet.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
Referências
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neurociência. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
