Summary

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Published: June 30, 2019
doi:

Summary

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Abstract

Geniş tüm genom sıralamasının birçok potansiyel protein sağlayan pek çok açık okuma çerçeveleri (ORFs) belirledi. Bu proteinlerin hücre için önemli rolleri olabilir ve yeni hücresel süreçleri çözebilir. Proteinler arasında, kinazlar, hücre sinyalizasyon yollarına ait olduğu ve hücre büyümesi, bölünme, farklılaşma, motilite ve ölüm gibi hücrenin kaderi için önemli olan birçok işlemi açma veya kapama yeteneğine sahip olduğu için önemli aktörlerdir.

Bu çalışmada, yeni bir potansiyel kinaz proteini, LIMK2-1 üzerinde duruldu. Biz Batı Blot tarafından belirli bir antikor kullanarak varlığını göstermiştir. Biz koimmünoprecipitation deneyler kullanarak upstream düzenleyen protein ile etkileşimi değerlendirdi. Coimmünoprecipitation iki hedef proteinleri arasındaki etkileşimi algılamak mümkün olan çok güçlü bir tekniktir. Ayrıca bir yem proteini yeni ortakları algılamak için kullanılabilir. Yem protein ya kendi sırasına yönelik bir etiket veya özellikle onu hedefleyen bir antikor yoluyla arındırılmış olabilir. Bu protein kompleksleri daha sonra SDS-PAGE (sodyum Dodecyl sülfat Poliakrilamid jel) ile ayrılabilir ve kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilebilir. İmmunoprecip, LIMK2-1 de onun kinaz aktivitesini test etmek için kullanıldı in vitro tarafından γ [32P] ATP etiketleme. Bu iyi kurulan tahlil birçok farklı substratlar kullanabilirsiniz, ve yem mutasyonlu sürümleri belirli kalıntıları rolünü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin hem son derece hassas hem de nicel olduğundan farmakolojik ajanların etkileri de değerlendirilebilir. Yine de, radyoaktivite işleme özellikle dikkatli gerektirir. Kinaz aktivitesi de değiştirilmiş amino asit Fosfo grubunu hedefleyen spesifik antikorlar ile değerlendirilebilir. Bu tür antikorlar tüm fosho değiştirilmiş kalıntıları için ticari olarak mevcut değildir.

Introduction

Onlarca yıl boyunca, çok sayıda sinyalizasyon yolları aydınlatılamamıştır ve hücre bölünmesi, farklılaşma, motilite, programlanmış hücre ölümü, bağışıklık ve Nörobiyoloji gibi önemli hücresel süreçlere katılımı gösterildi. Kinazlar, bu sinyal yollarında, aktivasyon veya inaktivasyonunu genellikle ince olarak düzenleyen ve dış uyaranlara1,2,3yanıt veren geçici çok yönlü kompleksleri bir parçası olarak önemli bir rol oynamaktadır. Mutasyon ve kinazlar disregülasyon genellikle insanlarda hastalıklara yol, ve bu nedenle son 40 yıl içinde en önemli uyuşturucu hedefleri biri haline gelmiştir4.

Bu bağlamda, upstream regülatörleri veya aşağı alt substratlar ile kinaz etkileşimi tespit etmek ve yeni ortakları tespit edebilmek için önemlidir. Yakınlık arıtma ve immünoprecipitation protein kompleksleri yalıtımı için çok güçlü tekniklerdir5. Yem protein veya kinaz belirli bir peptit dizisi ile kovalently peptit hedefleyen antikorlar ile birleştiğinde ticari boncuk kullanımına izin etiketli olabilir. Bu malzeme deneyler6,7,8yüksek bir yeniden üretilebilirliği izin verir. Endojen proteinleri de doğrudan yem protein hedefleyen antikorlar kullanarak immünoprecip, olabilir. Antikorlar protein A veya protein G agaroz boncuklar çapraz bağlantılı olabilir ya da sadece lysate eklemeden önce bu boncuklar ile inkübe. Liziz tamponları, etkileşimi kaybetmeden protein çözünmesine izin vermek ve protein bozulmasını önlemek için optimize edilmelidir. Bu yaklaşımın büyük bir dezavantajı, etkileşimin hücre lizisi üzerine algılanması; Bu nedenle, geçici veya zayıf etkileşimler, alt hücre bağlamı gerektiren ile birlikte cevapsız olabilir. Diğer teknikler, Proximity ligasyon tahlil (PLA)9, In vivo çapraz bağlama destekli benzeşme arıtma (xap)10, Bioluminescence rezonans enerji transferi (Bret) veya Förster rezonans enerjisi gibi doğrudan hücrede çalışmak için kullanılabilir Transfer (fret)11,12. Ayrıca, immünoplikoterapi, yüzey plasmon rezonans, Isothermal titrasyon kalorimetri veya Microscale Thermophoresis gibi fiziksel tekniklerin gerekli olduğu bağlayıcı termodinamik sabitler belirlemek için uygun değildir 13,14.

Kinaz aktivitesi birden fazla teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, fosho spesifik antikorlar üzerinde duruldu ve in vitro γ [32P] ATP (adenozin trifosfat) etiketleme. Phospho spesifik antikorlar bir protein içinde belirli bir kalıntı fosfat modifikasyonu hedef. Onlar Batı Blot veya ELISA kullanılabilir (enzim bağlantılı Immünosorbent assay) hücre lizis sonra, immünhistokimya, ve aynı zamanda akış sitometri veya immünofluorescence kullanarak bozulmamış hücreler üzerinde. Bunların dezavantajları, hedef proteinin mutasyona uğramış bir versiyonunu kullanarak değerlendirilebilen ve tüm proteinler için ticari olarak kullanılmaması açısından özgüllük eksikliği içerebilir. In vitro γ [32P] ATP etiketleme çok sağlam, iyi kurulmuş ve son derece hassas bir yöntemdir15. İmmunopmanite veya rekombinant proteinler kullanılabilir ve farklı substratlar test edilebilir. Bu yöntem nicel olduğu için ilaçların etkileri de değerlendirilebilir. Büyük dezavantajı, yaklaşım ile ilişkili radyoaktivite dikkatli işleme gerektirir. Floresan veya ışıldayan peptid substratların ölçümüne dayalı ve fosforilasyon üzerine değiştirilmiş floresan/ışıldayan özelliklerinden yararlanarak alternatif yöntemler de mümkündür. Bu tür yöntemler de, örneğin, hedef kinaz potansiyel inhibitörleri olabilir moleküllerin taramasında gerekli olan yüksek verim, izin verir. Gerçekten de, kinazlar ilaç şirketleri tarafından izlenen uyuşturucu hedefleri en büyük sınıflarından birini temsil16.

Bu çalışmada LIMK2-1 proteini (LIMK2-1 Lin11, Isle1, Mec3 kinase izoformu 2-1) üzerinde duruldu. LIMK2 kinaz proteini ilk olarak 199517‘ de tanımlanmıştır. LIMK2 üç izoformlarının alternatif birleştirme tarafından üretilir: LIMK2a, LIMK2b ve LIMK2-1. Şu anda, LIMK2-1 sadece tek bir çalışmada18mRNA düzeyinde açıklanmıştır. Burada, bu potansiyel yeni kinaz proteini moleküler düzeyde güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak karakterize ediyoruz. Öncelikle, LIMK2-1 ‘ in gerçekten sentezlenmiş olduğunu gösteriyoruz. Onun iki karşı benzer, LIMK2a ve LIMK2b, upstream kinaz ROCK ile etkileşime girer (Rho-ilişkili protein kinaz). Biz LIMK2-1 myelin temel protein (MBP) üzerinde bir kinaz aktivite olduğunu göstermek, ama cofilin değil, LIM kinazlar ve kurallı substrat.

Protocol

1. transfeksiyon için hücre hazırlığı DIKKAT: hücre kültürünün tüm adımlarının özel bir laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir ve hücreler sınıf 2 mikrobiyolojik kabine içinde manipüle edilir. Tohum HEK-293 (Insan embriyonik böbrek) Ø 10 cm plaklarda 10 mL DMEM (Dulbecco ‘nun modifiye Eagles Medium) hücrelerinde% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmektedir. Kültür 3 ila 5 gün altında 5% CO2, at 37 °c, hücreler ulaşıncaya kadar ~ 90% C…

Representative Results

LIMK2-1 protein sentezlenmişLIMK2-1 databanks belirtilmiştir, ancak şimdiye kadar sadece bir kağıt onun mRNA18varlığını göstermiştir. İki homolog ile karşılaştırıldığında, LIMK2a ve LIMK2b, LIMK2-1 protein fosfataz 1 Inhibitör etki alanı (PP1i) olarak tanımlanan ekstra bir C-Terminal etki alanı vardır. Biz bu alan bir peptit hedefleyen bir antikor tasarladık, amino asitler 671-684 (Şekil 1a</stron…

Discussion

Burada, moleküler düzeyde yeni bir protein olan LIMK2-1 ‘ e göre, dizisine ve homologlarında, LIMK2a ve LIMK2b20‘ ye dayanan bir kinaz olduğuna inanılan sağlam biyokimyasal araçlar kullandık.

Öncelikle, biz belirli bir antikor ile Batı Blot analizi kullanarak protein düzeyinde LIMK2-1 varlığını göstermiştir. Bunun ardından, LIMK2-1 homologlarını LIMK2a ve LIMK2b düzenleyen bilinen upstream kinaz rock1 ile etkileşimi değerlendirildi. Son olarak, L…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma la Ligue contre le Cancer, l ‘Association Neurofibromatoses et Recklinghausen ve La Région Centre Val de Loire tarafından destekleniyordu. Akış sitometri verileri için Aurélie Cosson ve Déborah Casas ve el yazması tam redaksiyon için keyron Hickman-Lewis çok teşekkür ederiz.

Materials

Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for g[32P] labeling
g[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for g[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
b-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
b-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for g[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for g[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

Referências

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neurociência. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

View Video