Isolering af lamina propria mononukleare celler fra murine Colon ved hjælp af collagenase E
Summary
Målet med denne protokol er at isolere mononukleare celler, der bor i lamina propria i tyktarmen ved enzymatisk fordøjelse af vævet ved hjælp af collagenase. Denne protokol giver mulighed for effektiv isolering af mononukleare celler, hvilket resulterer i en enkelt cellesuspension, som igen kan bruges til robust immunophenotyping.
Abstract
Tarmen er hjemsted for det største antal immunceller i kroppen. De små og store tarm immun systemer politi eksponering for eksogene antigener og moduere responser på potente mikrobielt afledte immun stimuli. Af denne grund, tarmen er et stort mål sted for immun dysregulering og betændelse i mange sygdomme, herunder, men ikke begrænset til inflammatoriske tarmsygdomme såsom Crohns sygdom og colitis ulcerosa, graft-versus-Host sygdom (GVHD) efter knogle knoglemarv transplantation (BMT), og mange allergiske og smitsomme tilstande. Murine modeller af gastrointestinal inflammation og colitis er stærkt anvendt til at studere GI komplikationer og til præ-klinisk optimere strategier for forebyggelse og behandling. Data hentet fra disse modeller via isolation og fænotypisk analyse af immunceller fra tarmen er afgørende for yderligere immun forståelse, der kan anvendes til at forbedre gastrointestinale og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne rapport beskriver en meget effektiv protokol til isolering af mononukleare celler (MNC) fra tyktarmen ved hjælp af en blandet silica-baseret tæthed gradient interface. Denne metode reproducerbart isolerer et betydeligt antal levedygtige leukocytter samtidig minimere kontaminerende snavs, tillader efterfølgende immun fænotypebestemmelse ved flow cytometri eller andre metoder.
Introduction
Selvom mave-tarmkanalen primært er dedikeret til behandling og reabsorption af næringsstoffer fra fødevarer, bevarer GI-kanalen også centrale roller i integriteten af vaskulære, lymfe-og nervesystemer og mange andre organer gennem dets slimhinde og submucosale immunsystem1. GI immunsystemet har en indflydelsesrig rolle i både gastrointestinal og systemisk sundhed på grund af sin konstante udsættelse for udenlandske antigener fra fødevarer, kommensal bakterier, eller invaderende patogener1,2. Således, GI immunsystemet skal opretholde en delikat balance, hvor det tolererer ikke-patogene antigener samtidig reagere passende på patogene antigener1,2. Når balancen i tolerance og forsvar er forstyrret, lokaliseret eller systemisk immun dysregulering og betændelse kan forekomme resulterer i et utal af sygdomme1,2,3.
Tarmen havne mindst 70% af alle lymfoide celler i kroppen4. De fleste primære immunologiske interaktioner involverer mindst én af tre immun stationer i tarmen: 1) Peyers patches, 2) Intraepiteliale lymfocytter (IEL) og 3) lamina propria lymfocytter (LPL). Hver af disse består af et komplekst sammenkoblet netværk af immunceller, der hurtigt reagerer på normale immun udfordringer i tarmen5. Begrænset til stroma over muscularis mucosae, den løst strukturerede lamina propria er bindevæv i tarmslimhinden og omfatter stilladser til villus, Vaskulaturen, lymfedrænage og slimhinde nervesystem, samt mange medfødte og adaptive immun undersæt6,7,8,9. LPL består af CD4+ og CD8+ T celler i et omtrentligt forhold på 2:1, plasmaceller og myeloid Lineage celler herunder, dendritiske celler, mastceller, eosinofile og makrofager6.
Der er en stigende interesse i at forstå immun dysregulering og betændelse i tarmen, da det vedrører forskellige sygdomstilstande. Sådanne tilstande som Crohns sygdom og colitis ulcerosa alle manifesterer varierende niveauer af Colon inflammation10,11,12. Desuden kan patienter med maligne eller ikke-maligne lidelser i marv eller immunsystemet, som gennemgår en allogen knoglemarvstransplantation (Allo-BMT), udvikle forskellige former for colitis, herunder 1) direkte toksicitet fra konditioneringsregimer før BMT, 2) infektioner forårsaget af immunsuppression efter BMT og 3) graft-versus-Host sygdom (gvhd) drevet af donor-type T-celler reagerer på donor Allo-antigener i vævet efter BMT13,14,15. Alle disse post-BMT komplikationer resulterer i betydelige ændringer i immunforsvaret af tarmene16,17,18. Den foreslåede metode muliggør en pålidelig vurdering af immuncelle akkumulering i muse tyktarmen og, når den anvendes til murine modtagere efter BMT, letter en effektiv analyse af både donor og recipient immunceller involveret i transplantations tolerance19 ,20. Yderligere årsager til tarmbetændelse omfatter maligniteter, fødevareallergi, eller afbrydelse af tarm mikrobiome. Denne protokol giver adgang til Gut mononukleare celler fra tyktarmen og, med ændringer, til leukocytter af tyndtarm i nogen af disse prækliniske murine modeller.
En PubMed søgning ved hjælp af søgeordene “tarm og immuncelle og isolation” afslører over 200 publikationer, der beskriver metoder til tyndtarm fordøjelse til at udtrække immunceller. Men en lignende litteratursøgning for Colon giver ingen velafgrænsede protokoller, der specificerer isolering af immunceller fra tyktarmen. Dette kan være fordi tyktarmen har mere muskuløs og interstitiel lag, hvilket gør det vanskeligere at helt fordøje end den lille tarm. I modsætning til eksisterende protokoller, denne protokol specifikt bruger collagenase E fra Clostridium histolyticum uden andre bakterielle kollagenaser (collagenase D/collagenase I). Vi viser, at ved hjælp af denne protokol, kan fordøjelsen af det koloniske væv opnås samtidig bevare kvaliteten af isolerede tarm mononukleiske immunceller (MNC) uden tilsætning af anti-clumping reagenser såsom natrium versenate (EDTA), Dispase II, og deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Denne protokol er optimeret til at tillade reproducerbar robust udvinding af levedygtige MNC fra murine kolon for yderligere rettet undersøgelser og bør egner sig til studiet af immunologi af tyktarmen eller (med ændringer) tyndtarmen24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne visuelle protokol beskriver veltolereret metoder til isolering af koloniske mononukleare celler, herunder lamina propria lymfocytter (LPL). I betragtning af, at denne protokol blev optimeret til at evaluere alvorlige post-transplantation muse colitis modeller, hvor inflammatoriske cytokiner og vævsskade egner sig til dårlig levedygtighed af genvundet MNC, vi forventer, at disse metoder kan oversættes til andre applikationer, der kræver fænotypisk analyse af Colon MNC. Disse omfatter, men, er ikke begrænset ti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Grants #1K08HL088260 og #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), og Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 og BALB/c mus, der anvendes i denne undersøgelse blev enten opdrættet i vores facilitet eller leveres af Jackson Labs eller Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
Referências
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
