Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.
Abstract
Der Darm ist die Heimat der größten Anzahl von Immunzellen im Körper. Die kleinen und großen Darm-Immunsysteme Polizei Exposition gegenüber exogenen Antigenen und modulieren Reaktionen auf potente mikrobiell abgeleitete Immunreize. Aus diesem Grund ist der Darm ein wichtiger Zielort für Immundysregulation und Entzündungen bei vielen Krankheiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) nach Knochen Knochenmarktransplantation (BMT) und viele allergische und infektiöse Erkrankungen. Murine Modelle von Magen-Darm-Entzündung und Kolitis werden stark verwendet, um GI-Komplikationen zu studieren und vorklinisch zu optimieren Strategien für Prävention und Behandlung. Daten, die aus diesen Modellen über Isolation und phänotypische Analyse von Immunzellen aus dem Darm gewonnen werden, sind entscheidend für ein weiteres Immunverständnis, das zur Linderung gastrointestinaler und systemischer entzündlicher Erkrankungen angewendet werden kann. Dieser Bericht beschreibt ein hochwirksames Protokoll zur Isolierung mononuklearer Zellen (MNC) aus dem Doppelpunkt unter Verwendung einer gemischten, auf Kieselsäure basierenden Dichtegradientenschnittstelle. Diese Methode isoliert reproduzierbar eine signifikante Anzahl lebensfähiger Leukozyten und minimiert dabei die Kontamination von Schmutz und ermöglicht eine nachträgliche Immun-Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder andere Methoden.
Introduction
Obwohl der Magen-Darm-Trakt (GI) in erster Linie der Verarbeitung und Resorption von Nährstoffen aus Der Nahrung gewidmet ist, behält der GI-Trakt auch zentrale Rollen in der Integrität des Gefäß-, Lymph- und Nervensystems und zahlreicher anderer Organe durch schleimhaut- und submukosalenImmunsystems 1. Das GI-Immunsystem hat eine einflussreiche Rolle sowohl in der gastrointestinalen als auch in der systemischen Gesundheit aufgrund seiner konstanten Exposition gegenüber fremden Antigenen aus Lebensmitteln, kommensalen Bakterien oder eindringenden Krankheitserregern1,2. So muss das GI-Immunsystem ein empfindliches Gleichgewicht aufrechterhalten, in dem es nicht pathogene Antigene toleriert und gleichzeitig angemessen auf pathogene Antigene1,2reagiert. Wenn das Gleichgewicht von Toleranz und Verteidigung gestört ist, können lokalisierte oder systemische Immundysregulation und Entzündungen auftreten, was zu einer Vielzahl von Krankheiten1,2,3führt.
Der Darm beherbergt mindestens 70% aller Lymphzellen im Körper4. Die meisten primären immunologischen Wechselwirkungen umfassen mindestens eine von drei Immunstationen im Darm: 1) Peyer es Patches, 2) Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) und 3) Lamina propria Lymphozyten (LPL). Jeder von ihnen besteht aus einem komplexen vernetzten Netzwerk von Immunzellen, die schnell auf normale Immunherausforderungen im Darm reagieren5. Beschränkt auf die Stroma über der Muskulatur, ist die lose strukturierte Lamina propria das Bindegewebe der Darmschleimhaut und umfasst Gerüste für den Villus, die Vaskulatur, Lymphdrainage und das Mukosalnervensystem sowie viele angeborene und adaptive Immun-Teilmengen6,7,8,9. LPL bestehen aus CD4+ und CD8+ T-Zellen in einem ungefähren Verhältnis von 2:1, Plasmazellen und myeloischen Abstammungszellen einschließlich, dendritischen Zellen, Mastzellen, Eosinophilen und Makrophagen6.
Es gibt ein wachsendes Interesse am Verständnis der Immundysregulation und Entzündung des Darms, wie es zu verschiedenen Krankheitszuständen betrifft. Solche Bedingungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa manifestieren alle unterschiedliche Konzentrationsniveaus der Darmentzündung10,11,12. Darüber hinaus können Patienten mit bösartigen oder nicht-bösartigen Erkrankungen des Markoder Immunsystems, die sich einer allogenen Knochenmarktransplantation (allo-BMT) unterziehen, verschiedene Formen der Kolitis entwickeln, einschließlich 1) direkte Toxizität durch Konditionierungsschemas vor BMT, 2) Infektionen, die durch Immunsuppression nach BMT und 3) Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) verursacht werden, die von Spender-Typ-T-Zellen angetrieben werden, die auf Spender-Allo-Antigene im Gewebe nach BMT13,14,15reagieren. Alle diese Post-BMT-Komplikationen führen zu signifikanten Veränderungen im Immunmilieu des Darms16,17,18. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Immunzellakkumulation im Mausdoppel und ermöglicht, wenn sie auf murine Empfänger nach BMT angewendet wird, einen effizienten Test sowohl der Spender- als auch der Empfängerimmunzellen, die an der Transplantationstoleranz beteiligt sind19 ,20. Weitere Ursachen für Darmentzündungen sind Bösartige Erkrankungen, Lebensmittelallergien oder Störungen des Darmmikrobioms. Dieses Protokoll ermöglicht den Zugang von Darm mononukleären Zellen aus dem Dickdarm und, mit Modifikationen, zu Leukozyten des Dünndarms in einem dieser präklinischen murine Modelle.
Eine PubMed-Suche mit dem Suchbegriff “Darm UND Immunzelle UND Isolation” zeigt über 200 Publikationen, die Methoden zur Dünndarmverdauung zur Extraktion von Immunzellen beschreiben. Eine ähnliche Literatursuche nach Dickdarm ergibt jedoch keine gut abgegrenzten Protokolle, die die Isolierung von Immunzellen vom Dickdarm angeben. Dies kann daran liegen, dass der Dickdarm mehr muskel- und interstitielle Schichten hat, was es schwieriger macht, vollständig zu verdauen als der Dünndarm. Im Gegensatz zu bestehenden Protokollen verwendet dieses Protokoll speziell Collagenase E von Clostridium histolyticum ohne andere bakterielle Kollagene (Collagenase D/ Collagenase I). Wir zeigen, dass mit diesem Protokoll die Verdauung des Kolongewebes unter Beibehaltung der Qualität isolierter mononukleärer Darmimmunzellen (MNC) ohne Zugabe von antiklumpenden Reagenzien wie Natriumversenat (EDTA), Dispase II und Desoxyribonuklease I (DNAse I)21,22,23. Dieses Protokoll ist optimiert, um eine reproduzierbare robuste Extraktion von lebensfähigem MNC aus dem murinen Dickdarm für weitere gerichtete Studien zu ermöglichen und sollte sich für die Untersuchung der Immunologie des Dickdarms oder (mit Modifikationen) des Dünndarms24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses visuelle Protokoll beschreibt gut verträgliche Methoden zur Isolierung von mononukleären kolonischen Zellen einschließlich Lamina propria lymphozyten (LPL). Angesichts der Tatsache, dass dieses Protokoll bei der Bewertung schwerer Mauskolitismodelle nach der Transplantation optimiert wurde, bei denen entzündliche Zytokine und Gewebeverletzungen sich für eine schlechte Lebensfähigkeit von wiedergewonnenem MNC eignen, gehen wir davon aus, dass diese Methoden in andere Anwendungen, die eine phätotypische Analy…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien #1K08HL088260 und #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) und die Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) unterstützt. C57BL/6 und BALB/c Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden entweder in unserer Anlage gezüchtet oder von Jackson Labs oder Taconic bereitgestellt.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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