Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule mononucleari che risiedono nella lamina propria del colon dalla digestione enzimatica del tessuto usando il collagenae. Questo protocollo consente l’isolamento efficiente delle cellule mononucleari con conseguente sospensione a singola cellula che a sua volta può essere utilizzata per l’immunofenofizzazione robusta.
Abstract
L’intestino è la casa del maggior numero di cellule immunitarie nel corpo. Il piccolo e grande sistema immunitario intestinale polizia l’esposizione a antigeni esogeni e modula le risposte a potenti stimoli immunitari microbicamente derivati. Per questo motivo, l’intestino è un importante sito bersaglio di disregolazione immunitaria e infiammazione in molte malattie tra cui, ma, non limitato a malattie infiammatorie intestinali come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, innesto contro l’ospite (GVHD) dopo l’osso trapianto di midollo (BMT), e molte condizioni allergiche e infettive. I modelli Murine di infiammazione gastrointestinale e colite sono pesantemente utilizzati per studiare le complicazioni GI e per ottimizzare pre-clinicamente le strategie per la prevenzione e il trattamento. I dati ricavati da questi modelli attraverso l’isolamento e l’analisi fenotipica delle cellule immunitarie dall’intestino sono fondamentali per un’ulteriore comprensione immunitaria che può essere applicata per migliorare i disturbi infiammatori gastrointestinali e sistemici. Questo rapporto descrive un protocollo altamente efficace per l’isolamento delle cellule mononucleari (MNC) dal colon utilizzando un’interfaccia mista di gradiente di densità basata sulla silice. Questo metodo isola riproducibilmente un numero significativo di leucociti vitali riducendo al minimo i detriti contaminati, consentendo la successiva fenotipizzazione immunitaria mediante citometria di flusso o altri metodi.
Introduction
Sebbene il tratto gastrointestinale (GI) sia principalmente dedicato alla lavorazione e al riassorbimento dei nutrienti dagli alimenti, il tratto GI mantiene anche un ruolo centrale nell’integrità del sistema vascolare, linfatico e nervoso e di numerosi altri organi attraverso il suo sistema immunitario mucosale e submucosale1. Il sistema immunitario GI ha un ruolo influente nella salute gastrointestinale e sistemica a causa della sua costante esposizione a antigeni estranei da alimenti, batteri commensici o agenti patogeni invasori1,2. Pertanto, il sistema immunitario GI deve mantenere un delicato equilibrio in cui tollera gli antigeni non patogeni rispondendo in modo appropriato agli antigeni patogeni1,2. Quando l’equilibrio di tolleranza e difesa viene interrotto, localizzato o sistemico immune diregolazione e infiammazione può verificarsi con conseguente una miriade di malattie1,2,3.
L’intestino ospita almeno il 70% di tutte le cellule linfoidi nel corpo4. La maggior parte delle interazioni immunologiche primarie coinvolgono almeno una delle tre stazioni immunitarie dell’intestino: 1) Peyer’s Patches, 2) Linfociti intraeliali (IEL) e 3) linfociti di lamina (LPL). Ognuna di queste è costituita da una complessa rete interconnessa di cellule immunitarie che rispondono rapidamente alle normali sfide immunitarie nell’intestino5. Limitata allo stroma sopra la mucosae muscolosa, la lamina vagamente strutturata propria è il tessuto connettivo della mucosa intestinale e comprende impalcature per il villus, la vascolatura, il drenaggio linfatico e il sistema nervoso mucosale, così come molti e sottoinsiemi immunitari adattivi6,7,8,9. LPL è composto da celluleT CD4 e CD8 in un rapporto approssimativo di 2:1, cellule plasmatiche e cellule di lignaggio mieloidi tra cui, cellule dendritiche, mastociti, eosinofili e macrofagi6.
C’è un crescente interesse nella comprensione della disregolazione immunitaria e dell’infiammazione dell’intestino in quanto si prova per vari stati di malattia. Tali condizioni come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa manifestano tutti diversi livelli di infiammazione colonica10,11,12. Inoltre, i pazienti con disturbi maligni o non maligni del midollo o del sistema immunitario sottoposti a trapianto di midollo osseo allogenico (allo-BMT) possono sviluppare varie forme di colite, tra cui 1) tossicità diretta da regimi condizionanti prima del BMT, 2) infezioni causate dall’immunosoppressione dopo BMT e 3) malattia di innesto-contro-ospite (GVHD) causata da cellule T di tipo donatore che reagiscono agli allogenesti donatori nei tessuti dopo BMT13,14,15. Tutte queste complicazioni post-BMT provocano alterazioni significative nell’ambiente immunitario dell’intestino16,17,18. Il metodo proposto consente una valutazione affidabile dell’accumulo di cellule immunitarie nel colon del topo e, quando applicato ai destinatari murini dopo BMT, facilita un saggio efficiente delle cellule donatrici e immunitarie riceventi coinvolte nella tolleranza deitrapianti 19 ,20. Ulteriori cause di infiammazione intestinale includono malignità, allergie alimentari, o interruzione del microbioma intestinale. Questo protocollo consente l’accesso alle cellule mononucleari intestinali dal colon e, con modifiche, ai leucociti dell’intestino tenue in uno di questi modelli murini preclinici.
Una ricerca PubMed usando i termini di ricerca “intestine e cellule immunitarie e isolamento” rivela oltre 200 pubblicazioni che descrivono i metodi per la digestione dell’intestino tenue per estrarre le cellule immunitarie. Tuttavia, una ricerca simile alla letteratura per il colon non produce protocolli ben delineati che specificano l’isolamento delle cellule immunitarie dal colon. Questo può essere perché il colon ha strati più muscolari e interstiziali, rendendo più difficile da digerire completamente rispetto all’intestino tenue. A differenza dei protocolli esistenti, questo protocollo utilizza specificamente Collagenase E di Clostridium histolyticum senza altre collagene batteriche (Collagenase D/ Collagenase I). Dimostriamo che, utilizzando questo protocollo, la digestione del tessuto colonico può essere raggiunta preservando la qualità delle cellule immunitarie mononucleari dell’intestino isolate (MNC) senza l’aggiunta di reagenti anti-agglomeranti come il versinato di sodio (EDTA), diSpase II e deoxyribonuclease I (DNasie I)21,22,23. Questo protocollo è ottimizzato per consentire l’estrazione robusta riproducibile di MNC vitale dal colon murino per ulteriori studi diretti e dovrebbe prestarsi allo studio dell’immunologia del colon o (con modifiche) dell’intestino tenue24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo visivo descrive metodi ben tollerati per l’isolamento delle cellule mononucleari coloniche, tra cui i linfociti propria di lamina (LPL). Dato che questo protocollo è stato ottimizzato nella valutazione di modelli di colite murina pre-trapianto in cui le citochine infiammatorie e le lesioni tissutali si prestano alla scarsa redditività della MNC recuperata, prevediamo che questi metodi possono essere tradotti in altri applicazioni che richiedono l’analisi fenotipica del MNC colonico. Questi includono, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), e dalla Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). I topi C57BL/6 e BALB/c utilizzati in questo studio sono stati allevati nella nostra struttura o forniti da Jackson Labs o Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
Referências
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
