Summary

Isolering av lamina propria mononukleære celler fra murine Colon bruke Kollagenase E

Published: September 26, 2019
doi:

Summary

Målet med denne protokollen er å isolere mononukleære celler som ligger i lamina propria i tykktarmen ved enzymatisk fordøyelse av vevet ved hjelp av kollagenase. Denne protokollen gjør det mulig for effektiv isolering av mononukleære celler som resulterer i en enkelt celle suspensjon som i sin tur kan brukes til robuste immunfenotyping.

Abstract

Tarmen er hjemmet til det største antall immunceller i kroppen. Det liten og stor intestinal immun systemer politiet avsøring å eksogene antigener og modulere Svar å potent mikrobielt avledet immun stimuli. Av denne grunn er tarmen et viktig målområde for immun feilregulering og betennelse i mange sykdommer, inkludert men, ikke begrenset til inflammatoriske tarm sykdommer som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, pode-versus-host sykdom (GVHD) etter bein marg transplantasjon (BMT), og mange allergiske og smittsomme tilstander. Murine-modeller av gastrointestinal betennelse og kolitt er mye brukt til å studere GI komplikasjoner og til pre-klinisk optimalisere strategier for forebygging og behandling. Data samlet fra disse modellene via isolasjon og fenotypiske analyse av immunceller fra tarmen er avgjørende for ytterligere immun forståelse som kan anvendes for å forbedre Gastrointestinal og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne rapporten beskriver en svært effektiv protokoll for isolering av mononukleære celler (MNC) fra kolon ved hjelp av en blandet silica-basert tetthet gradient grensesnitt. Denne metoden reproduserbar isolerer et betydelig antall levedyktige leukocytter samtidig minimere forurensende rusk, slik at påfølgende immune bestemmelse av fenotype ved flyt flowcytometri eller andre metoder.

Introduction

Selv om Gastrointestinal (GI)-kanalen er primært dedikert til behandling og reabsorpsjon av næringsstoffer fra mat, opprettholder GI veiene også sentrale roller i integriteten av vaskulære, lymfatisk, og nervøse systemer og av mange andre organer gjennom sin slimhinne og submucosal immunsystem1. GI immune systemet har en innflytelsesrik rolle i både Gastrointestinal og systemisk helse på grunn av sin konstante eksponering for utenlandske antigener fra mat, Commensal bakterier, eller invadere patogener1,2. Dermed må gi immunforsvaret opprettholde en delikat balanse der det tåler ikke-patogene antigener mens svarer hensiktsmessig til patogene antigener1,2. Når balansen av toleranse og forsvar er forstyrret, lokaliserte eller systemisk immune feilregulering og betennelse kan oppstå som resulterer i en myriade av sykdommer1,2,3.

Tarmen havner minst 70% av alle lymfoide celler i kroppen4. De fleste primære Immunologic interaksjoner innebære minst én av tre uimottakelig stasjoner i tarmen: 1) Peyer ‘ s patcher, 2) intraepithelial-lymfocytter (IEL) og 3) lamina propria-lymfocytter (LPL). Hver av disse består av et komplekst sammenhengende nettverk av immunceller som raskt reagerer på normale immun utfordringer i tarmen5. Begrenset til stroma over muscularis mucosae, løst strukturert lamina propria er bindevev i tarmen mucosa og inkluderer stillas for villus, den blodkar, lymfatisk drenering, og slimhinnen nervesystemet, samt mange medfødt og adaptive immune undergrupper6,7,8,9. LPL består av CD4+ og CD8+ T celler i et omtrentlig forhold på 2:1, plasma celler og myelogen avstamning celler inkludert, dendrittiske celler, mastceller, eosinofile og makrofager6.

Det er en økende interesse i å forstå immun feilregulering og betennelse i tarmen som det gjelder ulike sykdomstilstander. Slike forhold som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt manifesterer alle varierende nivåer av colonic betennelse10,11,12. I tillegg kan pasienter med ondartede eller ikke-ondartede forstyrrelser i margen eller immunsystemet som gjennomgår en allogene benmarg transplantasjon (Allo-BMT) utvikle ulike former for kolitt inkludert 1) direkte toksisitet fra condition regimer før BMT, 2) infeksjoner forårsaket av immunsuppresjon etter BMT og 3) pode-versus-host sykdom (GVHD) drevet av donor-type T-celler reagerer på donor Allo-antigener i vevet etter BMT13,14,15. Alle disse post-BMT komplikasjoner resultere i betydelige endringer i immun miljøet i tarmen16,17,18. Den foreslåtte metoden gjør det mulig for en pålitelig vurdering av immun celle akkumulering i musen kolon, og når den brukes til murine mottakere etter BMT, forenkler en effektiv analyse av både donor og mottaker immunceller involvert i transplantasjon toleranse19 ,20. Ytterligere årsaker til tarmbetennelse inkluderer ondartet, matallergier, eller forstyrrelse av tarmen mikrobiomet. Denne protokollen gir tilgang til gut mononukleære celler fra kolon og, med modifikasjoner, til leukocytter av tynntarmen i noen av disse prekliniske murine modeller.

En PubMed søk ved hjelp av søkeordene “tarmen og immun celle og isolasjon” avslører over 200 publikasjoner som beskriver metoder for tynntarmen fordøyelsen å trekke ut immunceller. Men en lignende litteratursøk for kolon gir ingen godt avgrenset protokoller spesifisere isolering av immunceller fra kolon. Dette kan være fordi kolon har mer muskuløse og interstitiell lag, rendering det vanskeligere å fullstendig fordøye enn tynntarmen. I motsetning til eksisterende protokoller, bruker denne protokollen spesifikt Kollagenase E fra histolyticum uten andre bakterielle Collagenases (kollagenase D/kollagenase I). Vi viser at ved hjelp av denne protokollen, fordøyelsen av colonic vev kan oppnås samtidig bevare kvaliteten på isolerte gut mononukleære immunceller (MNC) uten tilsetning av anti-klumper reagenser som natrium versenate (EDTA), Dispase II, og deoxyribonuclease i (DNAse i)21,22,23. Denne protokollen er optimalisert for å tillate reproduserbar robust utvinning av levedyktige MNC fra murine kolon for videre rettet studier og bør låne seg til studiet av immunologi av kolon eller (med modifikasjoner) i tynntarmen24, 25på.

Protocol

Alle studier var gjennomførte under gnager forskning protokoller anmelder og anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av universitetet av Miami møllen skolen av medisin, hvilke møter det Veterinary standarder sette av amerikaneren forening for laboratorium dyr vitenskap (AALAS). 1. utarbeidelse av løsninger Som beskrevet i tabell 1, forberede Colon buffer, silica-baserte Density separasjon Media 100%, silica-basert tetthet separasjon Media 66%,…

Representative Results

Når du arbeider med murine Colon sykdom modeller, er det nyttig å kunne både kvantifisere og kvalitativt vurdere, blant MNC i tykktarmen, flere immun celle delsett involvert i den inflammatoriske prosessen. Den single-celle suspensjon av MNC innhentet gjennom anvendelsen av denne protokollen Letter slike fenotypiske karakterisering i en robust og reproduserbar måte. Som et bevis på prinsippet for anvendelsen av denne isolasjons metoden under diverse eksperimentelle innstillinger, vi …

Discussion

Denne visuelle protokollen beskriver godt tolerert metoder for isolering av colonic mononukleære celler inkludert lamina propria lymfocytter (LPL). Gitt at denne protokollen ble optimalisert i å evaluere alvorlig post-transplantasjon mus kolitt modeller hvor inflammatorisk cytokiner og vevsskade egner seg til dårlig levedyktighet av utvinnes MNC, forventer vi at disse metodene kan oversettes til andre applikasjoner som krever fenotypiske analyse av colonic MNC. Disse inkluderer, men, er ikke begrenset til å vurdere k…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd #1K08HL088260 og #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), og Batchelor Foundation for pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 og BALB/c mus som brukes i denne studien ble enten avlet i vårt anlegg eller levert av Jackson Labs eller Taconic.

Materials

60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10mL Syringe Becton Dickinson 302995
15mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18- gauge Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 micrometer pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

Referências

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
check_url/pt/59821?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

View Video