Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E
Summary
O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.
Abstract
O intestino é a casa para o maior número de células imunes no corpo. A exposição da polícia intestinal de pequenos e grandes sistemas imunológicos a antígenos exógenos e modulam respostas a potentes estímulos imunológicos derivados microbialmente. Por esta razão, o intestino é um local principal alvo de desregulação imune e inflamação em muitas doenças, incluindo mas, não limitado a doenças inflamatórias intestinais, como a doença de Crohn e colite ulcerosa, doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) após o osso transplante de medula óssea (TMO) e muitas condições alérgicas e infecciosas. Os modelos murinos de inflamação e colite gastrintestinal são fortemente utilizados para estudar as complicações do GI e para otimizar as estratégias de prevenção e tratamento pré-clinicamente. Os dados recolhidos destes modelos através da isolação e da análise fenotípica de pilhas imunes do intestino são críticos para uma compreensão imune mais adicional que possa ser aplicada para amenizar desordens inflamatórios gastrintestinais e sistemáticas. Este relatório descreve um protocolo altamente eficaz para a isolação de pilhas mononucleares (MNC) dos dois pontos usando uma relação sílica-baseada misturada do inclinação da densidade. Este método isola revisivelmente um número significativo de leucócito viáveis ao minimizar contaminando restos, permitindo o fenótipo imune subseqüente pela citometria do fluxo ou pelos outros métodos.
Introduction
Embora o trato gastrointestinal (GI) é principalmente dedicado ao processamento e reabsorção de nutrientes de alimentos, o trato gastrointestinal também mantém papéis centrais na integridade dos sistemas vasculares, linfáticos e nervosos e de numerosos outros órgãos através seu sistema imunológico mucoso e submucoso1. O sistema imunológico Gi tem um papel influente na saúde gastrointestinal e sistêmica, devido à sua exposição constante a antígenos estrangeiros de alimentos, bactérias comensais ou agentes invasores1,2. Assim, o sistema imunológico gastrointestinal deve manter um equilíbrio delicado no qual tolera antígenos não patogênicos enquanto respondesse apropriadamente aos antígenos patogênicos1,2. Quando o equilíbrio de tolerância e defesa é interrompido, a desregulação imune localizada ou sistêmica e a inflamação podem ocorrer resultando em uma infinidade de doenças1,2,3.
O intestino abriga pelo menos 70% de todas as células linfóides no corpo4. A maioria de interações imunológicas preliminares envolvem pelo menos uma de três estações imunes no intestino: 1) Peyer ‘ remendos de s, 2) linfócitos intraepithelial (IEL) e 3) linfócitos do própria do lamina (LPL). Cada uma delas é composta por uma complexa rede interconectada de células imunes que respondem rapidamente aos desafios imunes normais no intestino5. Restrita ao estroma acima da musculatura Mucosae, a lâmina própria vagamente estruturada é o tecido conjuntivo da mucosa intestinal e inclui andaimes para o villus, a vasculatura, drenagem linfática e sistema nervoso mucoso, bem como muitos inatos e subconjuntos imunes adaptativos6,7,8,9. As LPL são compostas por células T CD4+ e CD8+ em uma proporção aproximada de 2:1, células plasmáticas e células de linhagem mielóide, incluindo células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e macrófagos6.
Há um interesse crescente em compreender o desregulação imune e a inflamação do intestino como pertence aos vários Estados da doença. Tais condições como a doença de Crohn e colite ulcerosa todos manifestam diferentes níveis de inflamação do cólon10,11,12. Adicionalmente, os pacientes com desordens malignos ou não-malignos da medula ou do sistema imune que se submetem a uma transplantação allogeneic da medula (Allo-BMT) podem desenvolver várias formas da colite que incluem 1) toxicidade direta dos regimes condicionantes antes de BMT,2) infecções causadas por imunossupressão após BMT e 3) doença do enxerto versus hospedeiro (DECH) impulsionada por células T do tipo doador reagindo a antígenos de Allo nos tecidos após o BMT13,14,15. Todas essas complicações pós-BMT resultam em alterações significativas no ambiente imunológico dos intestinos16,17,18. O método proposto permite uma avaliação confiável do acúmulo de células imunes no cólon do camundongo e, quando aplicado aos receptores murinos após a TMO, facilita um ensaio eficiente de células imunes de doadores e receptores envolvidas na tolerância ao transplante19 ,20. Causas adicionais de inflamação intestinal incluem malignidades, alergias alimentares, ou perturbação do microbioma intestinal. Este protocolo permite o acesso de pilhas mononucleares do intestino do cólon e, com modificações, aos leucócito do intestino pequeno em alguns destes modelos murino pré-clínicos.
Uma pesquisa PubMed usando os termos de pesquisa “intestino e célula imune e isolamento” revela mais de 200 publicações descrevendo métodos para a digestão do intestino delgado para extrair células imunes. Entretanto, uma busca similar da literatura para dois pontos não rende nenhuns protocolos bem delineados que especificam a isolação de pilhas imunes dos dois pontos. Isto pode ser porque o cólon tem mais camadas musculares e intersticiais, tornando-o mais difícil de digerir completamente do que o intestino delgado. Diferentemente dos protocolos existentes, este protocolo utiliza especificamente a Collagenase E de Clostridium histolyticum sem outras colagenases bacterianas (Collagenase D/Collagenase I). Nós demonstramos que, usando este protocolo, a digestão do tecido relativo ao cólon pode ser conseguida ao preservar a qualidade de pilhas imunes mononucleares isoladas do intestino (MNC) sem a adição de reagentes antiaglutonantes tais como o versenate do sódio (EDTA), Dispase II, e desoxirribonuclease i (DNase i)21,22,23. Este protocolo é aperfeiçoado para permitir a extração robusta reprodutível de MNC viável do cólon murino para uns estudos dirigidos mais adicionais e deve emprestar-se ao estudo da imunologia do cólon ou (com modificações) o intestine pequeno24, a 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo Visual descreve métodos bem tolerados para a isolação de pilhas mononucleares Colônica que incluem linfócitos do própria do lamina (LPL). Dado que este protocolo foi otimizado na avaliação de modelos graves de colite pós-transplante de camundongo, onde citocinas inflamatórias e lesão tecidual se prestam à má viabilidade da MNC recuperada, prevemos que esses métodos podem ser traduzidos para outros aplicações que exigem a análise fenotípica do MNC relativo ao cólon. Estes incluem, mas, n?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) e pela Fundação Batchelor para pesquisa Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Os camundongos C57BL/6 e BALB/c utilizados neste estudo foram criados em nossas instalações ou fornecidos por Jackson Labs ou Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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