여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.
살아있는 세포 화상 진찰은 살아있는 세포에 있는 세포 그리고 단백질 역학을 검토하기 위하여 이용된 현미경 검사법 기술입니다. 이 화상 진찰 방법은 유독하지 않으며, 일반적으로 세포 생리학을 방해하지 않으며, 최소한의 실험 처리를 요구합니다. 기술적인 간섭의 낮은 수준은 연구원이 유사분열의 다중 주기에 걸쳐 세포를 공부하고 처음부터 끝까지 만이기스를 관찰하는 것을 가능하게 합니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 적색 형광 단백질 (RFP)와 같은 형광 태그를 사용하여 연구원은 전사, DNA 복제, 응집력 및 분리와 같은 프로세스에 중요한 다양한 요인을 분석 할 수 있습니다. 피지(무료, 최적화된 ImageJ 버전)를 사용한 데이터 분석과 결합된 라이브 셀 이미징은 단백질 이동, 국소화, 안정성 및 타이밍뿐만 아니라 핵 역학 및 염색체 분리를 평가하는 다양한 방법을 제공합니다. 그러나 다른 현미경 검사법의 경우와 마찬가지로, 살아있는 세포 이미징은 고배율에서 해상도 전력에 제한을 두는 빛의 본질적 특성에 의해 제한되며, 고파장에서 광표백 또는 광독성에 민감합니다. 주파수. 그러나, 몇몇 주의를 기울여, 조사자는 유사분열과 meiotic 사건의 적당한 시각화를 허용하기 위하여 적당한 조건, 긴장 및 형광마커를 신중하게 선택해서 이 물리적인 한계를 우회할 수 있습니다.
살아있는 세포 현미경 검사법은 연구원이 핵분열 효모 세포를 죽이지 않고 핵 역학을 검토하고 치명적인 고정식 및 얼룩에 대한 필요성을 제거합니다. 막과 세포골격 외에도 염색체 복제, 재조합 및 분리와 같은 중요한 사건에 관여하는 형광 태그단백질의 안정성, 운동, 국소화 및 타이밍을 관찰할 수 있습니다. 움직임. 세포 생존력과 무독성 신호 검출을 유지함으로써 최소한의 생리적 침입이 있습니다. 제대로 수행 할 때,이 현미경 검사법은 확장 된 기술 적 취급 또는 가짜 화학 반응성에서 발생하는 혼란 효과를 줄일 수 있습니다. 또한, 실험 중, 연구원은 핵분열 효모 영양 및 스트레스 상태, 증식 효율성 및 부적절한 이미징 매개 변수 또는 비정상적인 세포 생리학을 나타내는 세포 사멸 상태의 관련 관찰을 할 수 있습니다1 ,2,3.
미토시스와 만이기스는 핵 및 세포 분열이 특징입니다. 유사분열과는 반대로, 부모 세포가 딸 세포를 초래함에 따라 유전 적 함량이 반으로 줄어듭니다4. 라이브 셀 이미징은 공간 적 관계 이외에 시간적 차원을 제공하기 때문에 많은 수의 셀을 실시간으로 검사 할 수 있습니다. 살아있는 세포 현미경 검사법은 히스톤5,응집체 소단위6,미세관7,centromeres8,키네토초레9,성분에 대한 형광 태그를 사용하여 핵 분열의 역학을 조사할 수 있게 했습니다. 스핀들 폴 바디(SPB)10,염색체 여객 복합체(CPC)11. 염색체 분리 장치 의 외부, 살아있는 세포 화상 진찰은 또한 필요한 단백질의 행동을 붙잡습니다, 그러나 염색체 분리에서 직접 관련시키지 않습니다. 이들 단백질의 기능은 미세소관12,13,14에복제, 염색체 재조합, 핵 운동 및 염색체 부착에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이 관측은 그 기능적인 분대가 생화확적인 또는 유전 검사에 순종하지 않은 세포 사건의 더 나은 이해에 기여했습니다. 현미경 기술의 새로운 발전으로, 가난한 해상도, 광 표백, 광독성 및 초점 안정성과 같은 한계가 감소하여 유사분열 및 모방 핵 역학의 실시간 관찰을 용이하게합니다1. 2,3. Meiosis는 타이밍에 세심한주의를 필요로하는 말단 분화 경로이기 때문에 특히 도전적입니다.
이 프로토콜의 목적은 유사분열 및 감피증에서 실시간 핵분열 효모 핵 역학을 검사하기 위한 비교적 간단한 방법을 제시하는 것이다. 이를 위해서는 환경 적 스트레스에 노출되지 않은 세포를 사용하고, 장기간 이미징을 견딜 수있는 아가로즈 패드를 준비하고, 단일 세포 역학의 시각화를 용이하게하는 밀도로 세포를 장착해야합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 핵 역학 (Hht1-mRFP 또는 Hht1-GFP), 염색체 분리 (Sad1-DsRed), 세포 골격 역학 (Atb2-mRFP), 전사에 대한 유용한 마커역할을하는 형광 태그 단백질을 운반하는 세포를 사용합니다. G1/S(Tos4-GFP)에서 활성화되고, 감피증(Rec8-GFP)의 응집력 안정성을 제공합니다. 이 방법은 또한 특정 세포 프로세스에 대한질문을 해결하기 위해 다른 조합으로 사용될 수 있는 추가핵 및 세포질 마커(표 I)를 소개한다. 또한, 기본 피지 도구는 연구원라이브 세포 이미지를 처리 하 고 데이터의 다른 종류를 분석 하는 데 도움이 기능. 이 접근법의 강도는 단백질 역학, 타이밍 및 안정성의 실시간 관찰을 사용하여 유사분열과 간편분열의 적절한 실행을 위해 필수적인 프로세스를 설명하는 데서 비롯됩니다.
유사분열 및 만피증 중 살아있는 세포 이미징은 데이터 수집 중에 핵분열 효모 생리학을 실질적으로 방해하지 않고 핵 역학을 검사할 수 있는 기회를 제공합니다. 그러나, 세포가 환경 스트레스의 자유로운 원하는 밀도로 성장하기 위하여 주의를 기울여야 합니다; 그리고 만피증의 경우, 세포가 말단 분화 의 시간 동안 너무 일찍 또는 늦지 않도록 이미지화됩니다. 과잉 셀 룰 러 우 밀기, 기아, 그리고 부적 당한 성장 온도는 재현 할 수없는 관찰에 기여 하는 일반적인 요인. 또한, 균주 시공 중에 형광 태그가 표적 유전자의 기능을 방해하거나 전반적인 세포 적합성에 영향을 미치지 않는다는 것을 테스트하는 것이 중요합니다. 형광마커를 운반하는 균주의 표현형을 면밀히 검사하지 못하면 유사한 유전자형에 걸쳐 일관되지 않고 비교할 수 없는 결과를 초래할 수 있습니다.
현미경 아가로즈 패드는 조립이 간단하지만, 그들은 또한 귀중한 이미징 데이터를 얻기에 장애물을 제기 할 수 있습니다. 아가로즈 패드를 만드는 것은 세 개의 현미경 슬라이드를 서로 평행하게 배치하고, 중간 슬라이드에 용융 아가로스를 분배하고, 다른 슬라이드의 상단을 가로가는 슬라이드를 넣는 것만큼 간단합니다. 그러나, 내성, 상황별 아가로즈 패드를 제조하기 위해 폭 을 수정할 수 있는 슬라이드 메이커 장치를 조립하는 것이 유용하다. 패드 폭 유연성을 제공하는 간단한 슬라이드 메이커는 플랫폼 (파이펫 팁 홀더 또는 벤치), 두 개의 현미경 슬라이드 및 패드폭 조정 메커니즘 역할을하는 실험실 테이프로 구성됩니다 (그림 1A). 정확한 패드 두께는 이미징 시간 요구 사항, 아가로즈 브랜드, 온도, 커버 슬립 실란트, 증발 속도 등에 따라 달라집니다. 따라서, 데이터 수집 전에 이미징 시스템을 교정하여 기술적 재현성을 높이고 라이브 셀 이미징의 품질을향상시키는 것이 중요하다 1,2,3. 패드 표면, 강성 및 구성은 장시간 이미지 수집 중에 필수적입니다. 아가로즈는 배경 형광이 낮고 쉽게 성형 할 수 있으며 적절한 농도로 증발로 인한 구조적 변형을 견딜 수 있습니다. 또한 핵분열 효모 매체와 아가로즈를 결합해도 이미지 품질이 저하되지 않으며 여러 유사분열 및 감피증 주기를 연장관찰할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경 검사에 대한 기포를 피하는 것이 중요합니다. 아가로즈 패드 내부와 샘플 내에서 에어 포켓은 시간이 지남에 따라 확장되어 세포 이동을 일으키고 초점 평면을 방해합니다. 세포가 커버슬립 회전에 의해 효율적으로 확산되면 연구자들은 핵 융합에서 포출에 이르는 여러 세대의 유사분열 과정과 모방 사건을 따를 수 있습니다. 이미징 실험을 위한 올바른 패드를 만들고 선택하는 데는 시간이 걸리지만, 일단 달성되면 매우 유익한 현미경 관찰에 기여할 수 있습니다.
다른 방법의 경우와 마찬가지로, 살아있는 세포 현미경 검사법은 기술적 인 제한이 없습니다. 형광 태그가 붙은 단백질의 사용은 연구될 수 있는 무슨의 범위를 제한하는 실험에 경계를 소개합니다. 사진 표백 및 사진 독성은 장시간 이미지 수집의 전형적인 문제입니다. 그(것)들은 너무 오래 또는 너무 자주 짧은 파장에 세포를 노출시키지 않음으로써 중화될 수 있습니다. 핵분열 효모 라이브 세포 이미징에 사용되는 전형적인 형광 단백질인 GFP, CFP, YFP, mRFP 및 DsRed와 관련된 실험의 경우 일상적인 실험을 위해 5-15% 여기 광과 100-500ms 노출 시간을 사용하는 것이 일반적입니다. 그러나 이러한 매개 변수는 연구원의 특정 실험 요구 사항에 따라 변경됩니다. 또한, 60x 대물렌즈를 사용하여 0.5 μm 간격을 가진 9-13개의 섹션으로 구성된 z-stack은 핵분열 효모 세포의 두께를 해결하기에 충분하다. 더욱이, 형광 마커가 표적 단백질의 적당한 규칙 또는 기능을 방해하거나 가짜 표현형을 생성하지 않는다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 따라서, 다른 수단에 의해 관찰을 확증하기 위해 동일한 표적 유전자에 대해 상이한 형광 및 친화성 태그를 포함하는 균주를 구성하는 것이 바람직하다. 또한 실험 파라미터를 실험 전반에 걸쳐 재현할 수 있고 수집된 데이터가 다운스트림 분석1,3에적합하도록 하는 것은 연구자의 책임입니다. 어떤 기술도 형광 신호 검출시 선형성에 대한 신중한 관찰과 엄격한 검사를 통해 실험 시스템을 꼼꼼하게 검증하는 오랜 검증된 관행을 대체할 수 없습니다.
마지막으로, 원시 이미지를 수정하지 않는 형식으로 현미경 데이터를 분석하는 것이 중요합니다. Fiji는 원시 데이터 측정을 추적할 수 있는 우수한 문서화 도구를 제공하며 연구원이 단일 세션에서 다양한 셀 파라미터를 검사할 수 있도록 합니다. 이러한 기능뿐만 아니라 온라인 자습서 및 광범위한 문학 범위의 풍부한, 피지 측정을위한 중요한 도구, 분석, 유사분열과 편감에서 핵 분열 효모의 핵 역학을 설명하는 라이브 세포 이미징 데이터를 제시하기위한 중요한 도구.
The authors have nothing to disclose.
저자들은 이 원고의 준비를 더욱 즐거운 노력으로 만들어 준 나탈리아 라 포르카데와 몬 라페르테에게 감사를 표하고 싶습니다. 그들의 통찰력, 실험 아이디어 및 도덕적 지원으로이 작품의 완성에 기여 한 Forsburg 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIGMS R35 GM118109에서 SLF로 지원되었습니다.
60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
Adenine | Sigma | A-8751 | |
Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
Biotin | Sigma | B-4501 | |
Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
Citric acid | Sigma | C-0759 | |
Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
Cover slip | VWR | 16004-302 | |
CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
Histidine | Sigma | H8125-100g | |
Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
Incubator | Shell lab | #3015 | |
Inositol | Sigma | I-5125 | |
Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
Leucine | Sigma | L8912-100g | |
Lysine | Sigma | L5626-500g | |
Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
Vaseline | Equaline | F79658 | |
yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |