Coltivazione del Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) per studi sperimentali
Summary
I Doliolidi, tra cui la specie Dolioletta gegenbauri, sono piccoli zooplancton marina gelatinosi di significato ecologico che si trovano sui sistemi produttivi di scaffale subcontinentale in tutto il mondo. La difficoltà di coltivare questi delicati organismi limita la loro indagine. In questo studio vengono descritti gli approcci di coltivazione per la raccolta, l’allevamento e la manutenzione del doliolide Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Gli zooplancton gelatinosi svolgono un ruolo cruciale negli ecosistemi oceanici. Tuttavia, è generalmente difficile studiare la loro fisiologia, crescita, fecondità e interazioni trofiche principalmente a causa di sfide metodologiche, compresa la capacità di colture. Questo è particolarmente vero per il doliolide, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri si verifica comunemente nei sistemi produttivi di scaffale continentale subtropicale in tutto il mondo, spesso a concentrazioni di fioritura in grado di consumare una grande frazione della produzione primaria giornaliera. In questo studio, descriviamo approcci di coltivazione per la raccolta, l’allevamento e il mantenimento di D. gegenbauri allo scopo di condurre studi di laboratorio. D. gegenbauri e altre specie di doliolid possono essere catturati dal vivo utilizzando obliquamente towed conico 202 m reti a rete da una nave alla deriva. Le colture sono stabilite in modo più affidabile quando le temperature dell’acqua sono al di sotto dei 21 gradi centigradi e sono iniziate da gonozoidi immaturi, fostozoidi in scadenza e grandi infermieri. Le colture possono essere mantenute in vasi di coltura arrotondati su una ruota di plancton che ruota lentamente e sostenuta su una dieta di alghe coltivate nell’acqua di mare naturale per molte generazioni. Oltre alla capacità di stabilire colture di laboratorio di D. gegenbauri, dimostriamo che la condizione di raccolta, la concentrazione di alghe, la temperatura e l’esposizione all’acqua di mare naturalmente condizionata sono tutti fondamentali per la coltura crescita, sopravvivenza e riproduzione di D. gegenbauri.
Introduction
Lo zooplancton rappresenta la più grande biomassa animale dell’oceano, è componenti chiave nelle nate alimentari marine e svolge un ruolo importante nei cicli biogeochimici oceanici1,2. Lo zooplancton, anche se composto da un’enorme diversità di organismi, può essere grossolanamente distinto in due categorie: gelatinose e non gelatinose con pochi taxa intermedi3,4. Rispetto allo zooplancton non gelatinoso, lo zooplancton gelatinoso è particolarmente difficile da studiare a causa delle loro complesse storie di vita5e i loro tessuti delicati sono facilmente danneggiati durante la cattura e la manipolazione. Le specie di zooplancton gelatinose sono, quindi, notoriamente difficili da coltura in laboratorio e generalmente meno studiate rispetto alle specie non gelatinose6.
Tra i gruppi di zooplancton gelatinosi, uno abbondante e di importanza ecologica nell’oceano del mondo sono i Thaliaceani. I tunicati pelagici sono una classe di tunicati pelagici che includono gli ordini Salpida, Piromida e Doliolida7. I Doliolida, collettivamente chiamati doliolidi, sono piccoli organismi pelagici a forma di barile che possono raggiungere un’elevata abbondanza nelle regioni neritiche produttive degli oceani subtropicali. I Doliolidi sono tra i più abbondanti di tutti i gruppi zooplancton4,8. Come alimentatori di sospensioni, i doliolidi raccolgono particelle di cibo dalla colonna d’acqua creando correnti filtranti e catturandole sulle reti di muco9. Tassonomiamente, i doliolidi sono classificati nel phylum Urochordata10. Ancestrali ai cordati, e oltre al loro significato ecologico come componenti chiave dei sistemi pelagici marini, i taliacei sono importanti per comprendere le origini della storia della vita coloniale10,11 e l’evoluzione dei cordati5,7,10,12,13,14.
La storia della vita dei doliolidi è complessa e contribuisce alla difficoltà di coltivarli e sostenerli durante il loro ciclo di vita. Una rassegna del ciclo di vita e dell’anatomia doliolidi può essere trovata in Godeaux etal. Il ciclo di vita del doliolide, che comporta un’alternanza obbligatoria tra le fasi della storia sessuale e asessuata, è presentato nella Figura 1. Uova e spermatozoi sono prodotti dai gonozoidi ermatodici, l’unica fase solitaria del ciclo di vita. I gonozoidi rilasciano spermatozoi nella colonna d’acqua e le uova vengono fecondate internamente e rilasciate per svilupparsi in larve. Le larve si schiudono e si trasformano in ozooidi che possono raggiungere 1-2 mm. Suming suming conducive environmental conditions and nutrition, oozooids become early nurses within 1-2 days at 20 sC and initiate the colonial stages of the life cycle. Gli oozoidi producono cime sul loro stolone ventrale. Queste gemme lasciano lo stolone e migrano verso il cadoforo dorsale dove si allineano in tre file accoppiate. Le doppie file centrali diventano forozoidi e le due file doppie esterne diventano trofozoidi. Questi ultimi forniscono cibo sia all’infermiera che ai forozoidi16,17. I trofozoidi forniscono all’infermiera la nutrizione quando perde tutti gli organi interni. Con l’aumentare dell’abbondanza di trofozoidi, la dimensione dell’infermiera può raggiungere i 15 mm in laboratorio. Man mano che i forozoidi crescono, ingerino sempre più prede planctoniche e raggiungono 1,5 mm di dimensione prima di essere rilasciati come individui17. Un singolo infermiere può rilasciare > 100 forozoidi durante la sua durata18. Dopo che i forozoidi vengono rilasciati dal cadoforo, continuano a crescere e sono la seconda fase coloniale del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 5 mm, ogni forozoide sviluppa un gruppo di gonozoidi sul loro peduncolo ventrale. Questi gonozoidi possono ingerire particelle quando raggiungono 1 mm di lunghezza. Dopo che i gonozoidi hanno raggiunto le dimensioni da 2 a 3 mm vengono rilasciati dal forozoide e diventano l’unica fase solitaria del ciclo di vita. Una volta raggiunti i 6 mm di dimensione, i gonozoidi diventano sessualmente maturi17. I gonozoidi possono raggiungere 9 mm o più di lunghezza. I gonozoidi sono ermafroditici, lo sperma viene rilasciato a intermittenza mentre la fecondazione degli ovuli avviene internamente16,17. Quando il gonozooid è di 6 mm di dimensione, rilascia fino a 6 uova fecondate. Una coltura di successo richiede il sostegno alle esigenze specifiche di ognuna di queste fasi uniche della storia della vita.
A causa del significato ecologico ed evolutivo dei tualiacei, compresi i doliolidi, c’è bisogno delle metodologie di coltivazione per far progredire la comprensione della biologia unica di questo organismo, della fisiologia, dell’ecologia e della storia evolutiva19 . I Doliolidi hanno notevoli promesse come organismi modello sperimentale nella biologia dello sviluppo e nella genomica funzionale perché sono trasparenti e probabilmente hanno genomi semplificati20,21. La mancanza di metodi di coltivazione affidabili, tuttavia, ne ostacola l’utilità come modelli di laboratorio. Anche se una manciata di laboratori hanno pubblicato risultati basati su doliolidi coltivati, per i nostri approcci di coltivazione della conoscenza e protocolli dettagliati non sono stati pubblicati in precedenza. Sulla base di anni di esperienza, e tentativi di prova ed errore di coltivazione, lo scopo di questo studio era quello di rivedere le esperienze e di condividere i protocolli per la raccolta e la coltivazione di doliolidi, in particolare la specie Dolioletta gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di coltura doliolidi è stata stabilita nel corso degli ultimi decenni ed è stata utilizzata per sostenere la ricerca in diversi settori. Studi sperimentali nei nostri laboratori hanno sostenuto la pubblicazione di almeno 15 studi scientifici incentrati sull’alimentazione e la crescita18,26, riproduzione18,28, dieta6, 29, fisiologia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati alle molte persone che hanno contribuito alla conoscenza accumulata a questo progetto nel corso degli anni, tra cui G.-A. Paffenhàfer e D. Deibel che originariamente svilupparono questi protocolli. Anche M. Kàster e L. Lamboley hanno contribuito in modo significativo allo sviluppo di queste procedure. N.B. L’Pez-Figueroa e l’E.E. Rodriguez-Santiago hanno generato le stime dell’abbondanza di doliolidi fornite nella tabella 1. Questo studio è stato sostenuto in parte dai premi della US National Science Foundation OCE 082599, 1031263 a MEF, progetti collaborativi OCE 1459293 e OCE 14595010 a MEF e DMG e, il premio National Oceanic and Atmospheric Administration NA16SEC4810000 a DMG. Siamo grati all’equipaggio laborioso e professionale della R/V Savannah. Lee Ann DeLeo preparò le figure, Charles Y. Robertson rileviillo del manoscritto e James (Jimmy) Williams produsse la ruota del plancton
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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