Dyrkning af Havpelagiske Tunicate Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) til eksperimentelle undersøgelser
Summary
Doliolids, herunder arten Dolioletta gegenbauri, er lille gelatinøs Marine zooplankton af økologisk betydning fundet på produktive subkontinentale hylde systemer på verdensplan. Vanskeligheden ved dyrkning af disse delikate organismer begrænser deres undersøgelse. I denne undersøgelse beskriver vi dyrkningsmetoder til opsamling, opdræt og vedligeholdelse af doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Gelatinøse zooplanktoner spiller en afgørende rolle i havets økosystemer. Men det er generelt vanskeligt at undersøge deres fysiologi, vækst, frugtbarhed og trofiske interaktioner primært på grund af metodologiske udfordringer, herunder evnen til at kultur dem. Dette gælder især for doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri forekommer almindeligvis i produktive subtropiske kontinentale hylde systemer på verdensplan, ofte i Bloom koncentrationer i stand til at forbruge en stor brøkdel af den daglige primærproduktion. I denne undersøgelse beskriver vi dyrkningsmetoder til indsamling, opdræt og vedligeholdelse af D. gegenbauri med det formål at gennemføre laboratoriebaserede undersøgelser. D. gegenbauri og andre doliolid arter kan fanges levende ved hjælp af skrå trukne koniske 202 μm mesh plankton nets fra et drifting skib. Kulturer er mest pålideligt etableret, når vandtemperaturen er under 21 °C og er startet fra umodne gonozooider, modning phorozooider, og store sygeplejersker. Kulturer kan opretholdes i afrundede kultur fartøjer på et langsomt roterende plankton hjul og opretholdes på en diæt af dyrkede alger i naturligt havvand i mange generationer. Ud over evnen til at etablere laboratorie kulturer af D. gegenbauri, viser vi, at indsamlings betingelsen, alge koncentrationen, temperaturen og eksponeringen for naturligt konditioneret havvand er alle afgørende for kulturen etablering, vækst, overlevelse og reproduktion af D. gegenbauri.
Introduction
Zooplankton tegner sig for den største animalske biomasse i havet, er nøglekomponenter i Marine fødevare spindelvæv, og spiller vigtige roller i havets biogeokemiske kredsløb1,2. Zooplankton, selv om den består af en enorm mangfoldighed af organismer, kan groft skelnes i to kategorier: gelatinøse og ikke-gelatinøse med få mellemliggende taxa3,4. Sammenlignet med den ikke-gelatinøse zooplankton er gelatinøs zooplankton særligt svær at studere på grund af deres komplekse livshistorie5, og deres sarte væv beskadiges let under opsamling og håndtering. Gelatinøse zooplankton arter er derfor notorisk vanskelige at kulturen i laboratoriet og generelt mindre undersøgt sammenlignet med ikke-gelatinøse arter6.
Blandt gelatinøse zooplankton grupper, en rigelig og af økologisk betydning i verdenshavet er Thaliaceanerne. Thaliaceans er en klasse af pelagiske sækdyr, der omfatter ordrerne Salpida, Pyrosomida og Doliolida7. Doliolida, samlet kaldet doliolids, er små tøndeformede, frisvømmede pelagiske organismer, der kan nå høje mængder i produktive neritiske regioner i subtropiske oceaner. Doliolids er blandt de mest udbredte af alle zooplankton grupperne4,8. Som ophængs fødere samler doliolids madpartikler fra vandsøjlen ved at skabe filter strømme og fange dem på Slim nets9. Taksonomisk, doliolids klassificeres i phylum Urochordata10. Forfædres til kordatoerne, og i tillæg til deres økologiske betydning som centrale komponenter i Marine pelagiske systemer, Thaliaceans er af betydning for forståelsen af oprindelsen af koloniale livshistorie10,11 og udviklingen af chordates5,7,10,12,13,14.
Doliolids ‘ livshistorie er kompleks og bidrager til vanskelighederne ved dyrkning og opretholdelse af dem gennem deres livscyklus. En gennemgang af doliolid livscyklus og anatomi kan findes i Godeaux et al.15. Doliolids livscyklus, som indebærer en obligatorisk vekslen mellem seksuelle og aseksuelle stadier i livsforløbet, er præsenteret i figur 1. Æg og sperm produceres af de hermafroditiske gonozooider, den eneste ensomme fase af livscyklus. Gonozooider frigive sperm til vandsøjlen og æg er internt befrugtet og frigivet til at udvikle sig til larver. Larverne klækkes og omdannes til oozooider, der kan nå 1-2 mm. at antage gunstige miljøforhold og ernæring, oozooider bliver tidlige sygeplejersker inden for 1-2 dage ved 20 °C og indlede de koloniale stadier af livscyklus. Oozooider asekuelt producere knopper på deres ventrale stolon. Disse knopper forlade udløber og migrere til dorsale cadophore, hvor de line op i tre parrede rækker. De centrale dobbelt rækker bliver phorozooider, og de yderste to dobbelte rækker bliver trofozooider. Sidstnævnte giver mad til både sygeplejersken og phorozooider16,17. Trophozooider forsyner sygeplejersken med ernæring, da hun mister alle indre organer. Som den overflod af trophozooider stiger, kan størrelsen af sygeplejersken nå 15 mm i laboratoriet. Som phorozooider vokse, de indtager i stigende grad planktonopblomstringer bytte og nå ~ 1,5 mm i størrelse forud for at blive frigivet som individer17. En enkelt sygeplejerske kan frigive > 100 phorozooider i løbet af sin levetid18. Efter at phorozooider er frigivet fra cadophore, de fortsætter med at vokse og er den anden koloniale fase af livscyklus. Når de når ~ 5 mm i størrelse, hver phorozooid udvikler en klynge af gonozooider på deres ventrale pedonkel. Disse gonozooider kan indtage partikler, når de når ~ 1 mm i længden. Efter gonozooider har nået ~ 2 til 3 mm i størrelse de er frigivet fra phorozooid og blive den eneste ensomme fase af livscyklus. Når de når ~ 6 mm i størrelse, gonozooider bliver seksuelt modne17. Gonozooider kan nå 9 mm eller større i længden. Gonozooider er hermaphroditic, sperm frigives periodisk mens befrugtning af æggene opstår internt16,17. Når gonozooid er ≥ 6 mm i størrelse, det frigiver op til 6 befrugtede æg. Vellykket dyrkning kræver at understøtte de specifikke behov i hver af disse unikke livshistorie etaper.
På grund af den økologiske og evolutionære betydning af Thaliaceans, herunder doliolids, er der behov for dyrkningsmetoderne for at fremme forståelsen af denne organismes unikke biologi, fysiologi, økologi og evolutionære historie19 . Doliolids har et betydeligt løfte som eksperimentel model organismer i udviklingsmæssige biologi og funktionel genomforskning, fordi de er gennemsigtige og sandsynligvis har strømlinet genomer20,21. Manglen på pålidelige dyrkningsmetoder hæmmer imidlertid deres anvendelighed som laboratorie modeller. Selv om en håndfuld laboratorier har offentliggjort resultater baseret på dyrkede doliolids, er vores viden dyrkningsmetoder og detaljerede protokoller ikke tidligere blevet offentliggjort. Baseret på mange års erfaring, og forsøg og fejl dyrkning forsøg, formålet med denne undersøgelse var at gennemgå erfaringer og til at dele protokoller for indsamling og dyrkning af doliolids, specielt arten Dolioletta gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kapaciteten til at kultur doliolids er blevet etableret i løbet af de sidste mange årtier og er blevet brugt til at støtte forskning på flere områder. Eksperimentelle undersøgelser i vores laboratorier har støttet offentliggørelsen af mindst 15 videnskabelige undersøgelser fokuseret på fodring og vækst18,26, reproduktion18,28, Diet6, 29</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige over for de mange personer, der har bidraget med akkumuleret viden til dette projekt i årenes løb, herunder G.-A. Paffenhöfer og D. Deibel, som oprindeligt udviklede disse protokoller. M. Köster og L. Lamboley har også bidraget væsentligt til udviklingen af disse procedurer. N.B. López-Figueroa og Á.E. Rodríguez-Santiago har genereret de i tabel 1 fastsatte skøn over forekomsten af doliolid. Denne undersøgelse blev delvist støttet af US National Science Foundation Awards OCE 082599, 1031263 til MEF, samarbejdsprojekter OCE 1459293 og OCE 14595010 til MEF og DMG og, den nationale oceaniske og atmosfæriske administration Award NA16SEC4810007 til DMG. Vi er taknemmelige for den hårdtarbejdende og professionelle besætning af R/V Savannah. Lee Ann DeLeo udarbejdede tallene, Charles Y. Robertson korrekturlæser manuskriptet, og James (Jimmy) Williams fremstillede plankton hjulet
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
Referências
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous?. American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean’s minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D., Bone, Q. . The biology of pelagic tunicates. , 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
