ヒト多能性幹細胞(hPSC)から分化した細胞型を生成することは、大きな治療上の約束を持っていますが、依然として困難なままです。PSCは、多くの場合、適切な信号のセットで刺激された場合でも、区別することができない固有の不能を示します。ここでは、さまざまな PSC ライン間の多系統分化を強化する簡単なツールを説明します。
多能性幹細胞(PSC)の使用が増加しているにもかかわらず、様々な系統にわたって胚および誘導多能性幹細胞(ESCおよびiPSC)を効率的に分化する課題が残っています。多数の分化プロトコルが開発されていますが、細胞株間の変動性と分化率の低さは、これらのプロトコルの実装に関する課題を与えています。ここで説明するのは、PSC の差別化能力を高めるための簡単で安価な手段です。ジメチルスルホキシド(DMSO)の濃度が低い幹細胞の治療は、指示分化後に異なる細胞型に分化する様々なPSCの傾向を有意に増加することが以前に示されている。この技術は、ニューロンや皮質スフェロイドから平滑筋細胞や肝細胞に至るまで、異なる種(例えば、マウス、霊長類、ヒト)に対して有効であることが示されています。DMSO前処理は、細胞周期を調節し、分化シグナルに対してより応答性の高い幹細胞をプライミングすることにより、PSC分化を改善します。ここでは、PSCを選択の系統とより効率的に区別するための再現性と広く適用可能な手段として、この単純なツールを使用するための詳細な方法論を提供します。
多能性幹細胞の使用は、再生医療や幹細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物スクリーニングなどの生物医学研究の多くの進歩につながっています。また、より翻訳可能な研究とパーソナライズされた医療の全体的な見通しにつながっています。20年以上前に誘導された多能性幹細胞(iPSC)技術の出現により、研究者は体組織から多能性幹細胞を開発し、機能性細胞型に分化し、様々な病態を研究することができました。心血管疾患、神経疾患、免疫疾患。幹細胞分化技術では大きな進歩が見られましたが、ヒト胚性幹細胞(hESC)とiPSCを効果的に分化する上での課題は依然として残っており、異なる幹細胞技術の広範な使用を制限しています。研究プログラム。異なる細胞株とクローン間の固有の変動性は、幹細胞株を所望の線子1に分化するための障害を引き続き提起し続ける。さらに、hPSCから成熟した末期分化機能細胞を導出することは、多くの系統にわたって退屈で非効率的なプロセスのままである。実際、hPSCから分化した細胞は、多くの場合、機能性細胞2に終端的に分化することができない。患者に使用する幹細胞ベースの治療法をさらに動かすには、hPSCから生成される細胞の有効性を改善し、確実にする必要がある。
私たちの研究室は、iPSCとESCの両方を成熟した細胞タイプに分ける効率を大幅に高めるための迅速で安価なツールを確立しました。指向分化前の24時間から48時間の一般的な試薬ジメチルスルホキシド(DMSO)によるhiPSCおよびHESCの前処理は、幹細胞分化能力の顕著な改善をもたらすことがわかった。DMSOによる治療は、細胞周期の初期のG1期におけるhiPSCおよびHESCの割合を増加させ、細胞増殖、生存、分化の重要な調節子であるレチノブ芽腫タンパク質(Rb)3を活性化する。より最近の研究では、Rbとその家族がDMSOのプロ分化効果に必要であることが判明し、Rbの一時的な不活性化はDMSOの効果を抑制し、一時的な方法でRbの構成的活性化が強化される。DMSOの効果5.胚発生時の細胞周期と同様に、ESCおよびiPSCの細胞周期は、自己再生6、7、8を促進する略語G1相によって特徴付される。この省略されたG1フェーズは、より無制限の増殖を可能にしますが、分化4、9の可能性を制限します。G1での増殖停止を促進し、hESCおよびiPSCの細胞周期におけるチェックポイント制御を活性化することにより、DMSO治療は、指示された分化に続く細胞の運命の変化に対する細胞のプライムをプライムする。
現在までに、DMSO前処理は、30以上の対照および疾患特異的ヒトESCおよびiPSC細胞株3、5、ならびに幹細胞および他の分化における3つの生殖層すべてに対する分化能力を改善することが示されている。その後の研究における他の様々な成熟細胞型に対する細胞株10,11,12,13,14,15,16,17歳,18歳,19歳,20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27歳,28 (表1)さらに、DMSO治療は、非ヒト原発細胞21、23(例えば、マウス、霊長類、ウサギ)の分化を増強するのに有効であることが示されており、種間の共有メカニズムを示唆している。最後に、DMSO前処理は遺伝子編集技術にも拡張されており、ある特定の研究では、hESC/iPSCの24時間DMSO前処理がクラスター化規則的に間隔を空けた短いパリドロミックリピート(CRISPR)の能力を有意に増加させたことを示しています。/CRISPR関連タンパク質-9(Cas9)-意図しない突然変異を組み込むことなく非コードDNAの編集効率29.ここでは、幹細胞生物学および指向性分化におけるアプリケーションのためのHESCおよびiPSCのDMSO前処理の詳細な方法論を提供する。
要約すると、このプロトコルは、すべての原発性胚芽層、種々のタイプの特殊な前駆細胞、さらにはインビトロの機能的な成熟細胞タイプに対する多能性幹細胞(PSC)の分化能力を高めるためのシンプルで安価なツールを説明します。と生体内の設定で。図示は、私たちの研究室だけでなく、他の研究室で効果的に再現されている特定の分化プロトコルですが、選択した任意の分化プロトコルは、DMSO処理に続いて使用することができます。表1に示すように、多くの研究室は、異なるパラダイムを用いて一時的なDMSO処理後のPSC分化の増強を実証し、他の様々な末端細胞タイプを生成する。さらに、ここでの方法はヒトPSCの使用を説明するが、DMSO前処理は種間で利用することができ、マウス、ウサギ、霊長類PSCに有効であることが示されている。
DMSOの高用量は細胞傷害性であることが知られているが、この方法で使用される低用量(1%-2%)一過性の期間のために最小限の細胞死をもたらす。DMSO治療直後の全体的な細胞数は、細胞周期のG1期における細胞周期停止のDMSO促進のために減少する可能性があるが、以前の研究は、細胞が除去後の制御培養物と同じレベルの合流に達できることを示している。DMSO3.
DMSO前処理のパーセントと持続時間は、細胞株ごとに最適化する必要があります。治療時間は、細胞のサイクリング/倍増時間を考慮して調整する必要があります。例えば、マウスPSCのサイクリング時間は通常約15時間と短くなります。したがって、これらの細胞に対して15時間のDMSO処理で十分である。一部のラボでは、分化プロトコル中または低濃度で継続した場合にDMSO治療が有益であることが判明しています(表1参照)。一部のPSCラインは、特定の系統との差別化により修正可能である点に留意すべきである。例えば、HUES6細胞は分化に対する寛容性が低く、DMSO処理で顕著な改善が見られた(図2)。あるいは、図4および図5で使用されるHUES8細胞は、内皮分化に対して高い傾向を示している。したがって、決定的な内皮に向かう初期段階での分化のためのコントロールとDMSOの間の相違点が少なかった。それにもかかわらず、DMSO前処理の増強は、この細胞株における分化の後の段階で観察される(図4B)。DMSO処理は、2Dおよび3D細胞培養システムの両方に有効であるという点でも汎用性があり、細胞培養プレート上の様々なタイプのコーティング材料で使用することができ、成長と拡大を促進するさまざまなタイプのメンテナンス培地で動作します。hPSC(例えば、mTeSR、E8、MEF条件付きメディアなど)。
より一般的には、これらの結果は、多能性幹細胞の開始状態が、機能性細胞型への末端分化と同様に初期分化の傾向に強い影響を及ぼすことを示唆している。我々は以前に、DMSO治療がhPSC3、5のRbを介して機能することを示した。Rbは末端分化、細胞生存、および細胞41、42、43、44の遺伝的安定性を促進する上で重要な役割を果たし、したがって、細胞に対する持続的な影響を説明し得る。DMSO処理されたhPSCと区別されます。これらの初期の規制モードをターゲットにすることは、hPSCを差別化のためのより良い軌道に置き、最終的には再生医療の有用性を向上させる可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、スタンフォード大学医学部の助成金と、S.C.に授与されたシーベル・フェローシップによって支えられました。
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353046 | |
9-Position stir plate | Chemglass | CLS-4100 | |
Accutase | Gibco | 11105-01 | |
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
Advanced RPMI | Gibco | 12633012 | |
Alk5i II | Axxora | ALX-270-445 | |
all-trans retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
anti-Brachyury | R&D Systems | AF2085 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-C-peptide | Developmental Studies Hybridoma Bank | GN-ID4 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-FoxA2 | Millipore | 07-633 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Nkx2.2 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Nkx6.1 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank; | F55A12-supernatant | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Olig2 | EMD Millipore | MABN50 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Pax-6 | Biolegend | 901301 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Pdx1 | R&D Systems | AF2419 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-SOX1 | R&D Systems | AF3369 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | No variablity observed across different lot numbers |
B-27 Supplement, minus Vitamin A | Gibco | 12587010 | |
basic fibroblast growth factor | Gibco | PHG0264 | |
Betacellulin | Thermo Fisher Scientific | 50932345 | |
Chir99021 | Stemgent | 04-000-10 | |
CMRL 1066 | Corning | 99-603-CV | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAF1000 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Disposable Spinner Flasks | Corning, VWR | 89089-814 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Essential 6 Media | Gibco | A1516501 | |
FAF-BSA | Proliant | 68700 | |
FGF7 | PeproTech | 100-19 | |
Geltrex | Gibco | A1413202 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Human Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO Diagnostics | 80-INSHUU-E01.1 | |
ITS-X | Invitrogen | 51500056 | |
KGF | Peprotech | AF-100-19 | |
Knockout DMEM | Gibco | 10829018 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) | EMD Millipore | 642245 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354277 | |
MCDB-131 | Cellgro | 15-100-CV | |
MEM NEAA | Gibco | 11140050 | |
mTeSR 1 | StemCell Technologies | 5850 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
NaHCO3 | Sigma | S3817 | |
Noggin Fc Chimera Protein | R&D Systems | 3344-NG-050 | |
PdBU | EMD Millipore | 524390 | |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
Sant1 | Sigma-Aldrich | S4572 | |
SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
Smoothened Agonist, SAG | EMD Millipore | 566660 | |
StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | |
TrypLE | Gibco | 12604013 | |
Ultra-Low Attachment Microplates | Corning | 3471 | |
Vitamin C | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Wnt3a | R&D Systems | 5036-WN | |
XAV 939 | Tocris | 3748 | |
XXI | EMD Millipore | 565790 | |
Y-27632 | StemCell Technologies | 72302 |