Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .
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Artigo de método
Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor
Neste artigo
Resumo
Resumo
A diferenciação ex vivo de células-tronco hematopoiéticas humanas é um modelo amplamente utilizado para estudar a hematopoiese. O protocolo descrito aqui é para a diferenciação induzida citocinas de pilhas da haste e do progenitor de CD34+ hematopoietic às quatro pilhas myeloid da linhagem. As pilhas de CD34+ são isoladas do sangue humano do cabo de cordão umbilical e co-cultivadas com as pilhas STROMAL MS-5 na presença de cytokines. A caracterização de immunophenotypic das pilhas da haste e do progenitor, e as pilhas Myeloid diferenciadas da linhagem são descritas. Usando este protocolo, as pilhas de CD34+ podem ser incubadas com moléculas pequenas ou transadas com lentivirus para expressar mutações myeloid da doença para investigar seu impacto na diferenciação Myeloid.
Introdução
A diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é fundamental para a manutenção de níveis fisiológicos de todas as linhagens de células sanguíneas. Durante a diferenciação, em uma resposta coordenada às pistas extracelulares, incluindo fatores de crescimento e citocinas, as hscs primeiro dão origem a células de progenitoras multipotentes (MPP) que têm potencial lympho-mielóide1,2,3 ,4 (Figura 1). Os MPPs dão origem a progenitores mielóides comuns (CMPs) e progenitores linfoides comuns (CLPs) que....
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Protocolo
O sangue do cordão umbilical humano para experimentação foi doado por indivíduos sadios após consentimento informado para a Maricopa sistemas integrados de saúde (MIHS), Phoenix. As unidades desidentificadas foram obtidas por meio de um acordo de transferência de material entre a MIHS e a Universidade do Arizona.
1. reagentes e amortecedores
Nota: Prepare todos os reagentes e tampões condições estéreis em um armário de segurança biológico.
- Prepare o tampão estéril de PBS-BSA-EDTA (PBE) adicionando 7,2 mL da albumina de soro bovina estéril de 35% (BSA; use a classe estéril 35% BSA da cul....
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Resultados
A aplicação dos protocolos acima rende 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs e 1 (± 0,3) x 106 células CD34+ de uma unidade de sangue do cabo de ~ 100 ml. A percentagem de células CD34+ totais varia entre 80-90% (Figura 2A, B). A análise imunofenotípica pelo esquema descrito por Manz et al.5 demonstra que as células CD34+ tipicamente consistem em ~ 20% hscs e ~ 72% Mpps que são Lin-/Cd34+/C.......
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Discussão
O protocolo descrito aqui é apropriado para a diferenciação ex vivo de UCB derivado CD34+ hspcs às quatro linhagens Myeloid. A incubação inicial com uma mistura de citocina consistindo de SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula as células CD34+ . Subseqüentemente, a diferenciação é conseguida com um cocktail de SCF, de IL3, de Flt3L, de EPO, e de TPO. Nesta mistura, o SCF, o IL3, e o Flt3L são importantes para a sobrevivência e a proliferação de CD34+ hscs. ePO e TPO promovem a diferenciação para .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero, e Gabriella Ruiz de Maricopa sistemas integrados de saúde para as unidades de sangue de cabo de-identificado e doado, Mrinalini Kala para assistência com citometria de fluxo, e bandidos gays e Christopher seet para aconselhamento sobre diferenciação mielóide ex vivo. Este trabalho foi apoiado por fundos para S.S. dos institutos nacionais de saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e da sociedade americana de câncer (a pesquisa institucional Grant 74-001-34-IRG). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de sa....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de 0,4% de azul de tripano | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilua o material de trabalho para 0,2% em ácido tetra acético estéril 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Solução salina balanceada (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Diluir para 1x com água destilada estéril e pH para 7,2 |
| 2,5% de tripsina, sem vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Diluir o estoque de trabalho para 1x com estéril 1x PBS |
| 30 µ m Filtros de pré-separação | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% de albumina de soro bovino estéril | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend 420404 | Usado como um corante vivo/morto para eliminar células mortas da análise FACS | |
| Anticorpo anti-CD10-FITC humano (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use diluição |
| 1:20Anticorpo anti-CD11b-FITC humano (ativado) (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Uso diluição 1:5 |
| Anticorpo anti-CD123-APC humano (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Uso diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-CD14-PE humano (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Uso diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-CD19-FITC humano (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Uso diluição 1:5 |
| Anticorpo anti-CD235a-APC humano (Clone GA-R2 (HIR2)))BD | Biosciences | 551336 | Uso diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-CD235a-FITC humano (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Uso diluição 1:50 |
| Anticorpo anti-CD34-APC-Cy7 humano (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Uso diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-CD38-PE humano (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-CD3-FITC humano (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Uso diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-humano CD41a-PerCP-Cy5.5 (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Uso diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-humano CD45Ra-PE-Cy7 (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Uso diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-humano CD66b-PE-Cy7 (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Uso Diluição 1:20 |
| Anticorpo anti-CD7-FITC humano (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Uso diluição 1:20 |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Esterilize o filtro antes do uso |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) em pó com L-Glutamina | Gibco | 12100046 | Reconstitua 1 pacote para fazer 1 L de meio DMEM com bicarbonato de sódio, 10% de FBS e 1% de penicilina e estreptomicina. |
| Soro fetal bovino, fonte australiana, inativado por calor | Lote FB-22 | Omega Scientific | |
| Kit de microesferas CD34 humanas | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Trombopoetina Humana (TPO), grau de pesquisa | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Faça um estoque de 100 µ g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 50 ng/mL para diferenciação mielóide e meio de estimulação |
| L-Glutamina | Omega Scientific | GS-60 | Concentração de 2 mM no meio de estimulação |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| Separador magnético MidiMACS | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| Meio de fracionamento MNC (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 | Presente do laboratório de Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | Aqueça 800 mL de 1x PBS em um copo de vidro em uma placa de agitação em uma capa química a ~ 65 ° C. Adicione 10 g de pó de paraformaldeído. Para dissolver completamente o paraformaldeído, aumente o pH adicionando 1 N NaOH. Arrefecer e filtrar a solução e completar o volume até 1 l com 1x PBS. Ajuste o pH para 7,2. |
| Penicilina & Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poli-L lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | Faça um estoque de 10 mg/mL em 1x |
| PBS Eritropoietina humana recombinante alfa (rHu EPO-&alfa;) | BioBasic | RC213-15 | Faça um estoque de 2.000 unidades/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 4 unidades/mL para diferenciação mieloide Fragmento |
| de fibronectina humana recombinante (RetroNectina) | Takara | T100B | Use 20 µ g/mL diluído em 1x PBS estéril para revestir poços antes da estimulação de CD34+ HSCs. |
| Ligante humano recombinante Flt-3 (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Faça um estoque de 100 µ g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 5 ng/mL para diferenciação mielóide e 50 ng/mL em meio de estimulação |
| Interleucina-3 humana recombinante (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Faça um estoque de 100 µ g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 5 ng/mL para diferenciação mielóide e 20 ng/mL em meio de estimulação |
| Fator de células-tronco humanas recombinantes (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Faça um estoque de 100 µ g/mL em 1x PBS + 0,1% BSA. Use 5 ng/mL para diferenciação mielóide e 50 ng/mL em meio de estimulação |
| Meio livre de soro (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Bicarbonato de sódio | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa mancha, modificado | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use de acordo com as instruções do fabricante |
| Equipamento | |||
| BD LSR II citômetro de fluxo | BD Biosciences | ||
| Centrífuga | Sorvall Legend RT | ||
| Microscópio óptico | Olympus |
Referências
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L.
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Reimpressões e permissões
