ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化
Summary
ここでは、4つの骨髄系統に対する臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞の免疫発食特性特性およびサイトカイン誘導分化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルの応用には、CD34+細胞の骨髄性分化に対する骨髄疾患変異または小分子の影響に関する調査が含まれる。
Abstract
ヒト造血幹細胞の外生分化は造血症を研究するために広く使用されているモデルである。ここで説明するプロトコルは、4つの骨髄系統細胞に対するCD34+造血幹細胞および前駆細胞のサイトカイン誘導分化を用いる。CD34+細胞は、ヒト臍帯血から単離され、サイトカインの存在下でMS-5間質細胞と共培養される。幹細胞および前駆細胞の免疫表現型特性、および分化した骨髄系統細胞について記載されている。このプロトコルを使用して、CD34+細胞は、ミエロイド分化への影響を調べるために、小分子またはレンチウイルスでトランスベートして骨髄疾患変異を発現させ得る。
Introduction
造血幹細胞(HSC)の正常な分化は、すべての血球系統の生理学的レベルの維持に重要である。分化の間、成長因子およびサイトカインを含む細胞外手がかりに対する協調的な応答において、HSCは最初にリンパ浮腫電位1、2、3を有する多能性前駆体(MPP)細胞を生じる 、4 (図1)MMPは、一般的な骨髄前駆体(CMP)および系統制限されている一般的なリンパ前駆体(CLP)を生み出す。CLPは、B、T、およびナチュラルキラー細胞からなるリンパ系系統に分化する。CCMは、さらに2つの制限された前駆体集団、巨核球赤血球前駆体(MEP)、および顆粒球単球前駆体(GGP)を介して骨髄系統を生成する。MEPは巨核球と赤血球を生み出すのに対し、GGPは顆粒球と単球を生じる。CMPを介して生じるだけでなく、巨核球はまた、非正規経路5、6を介してHSCまたは初期のPMPから直接生じることが報告されている。
造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、表面マーカーCD34および系統特異的マーカーの欠如(Lin−)によって特徴付げられる。HSCと骨髄前駆体を区別するために一般的に使用される他の表面マーカーには、CD38、CD45RA、およびCD1232(図1)が含まれる。HPC と MMP はそれぞれ Lin–/CD34+/CD38–と Lin–/CD34+/CD38+です。骨髄性前駆体集団は、CD45RAおよびCD123の有無によって区別される。CCMはリン–/CD34+/CD38+/CD45RA–/CD123lo、GGP は Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo、 MEP は Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA–/CD123–.
CD34+幹および前駆細胞の総集団は、ヒト臍帯血(UCB)、骨髄、および末梢血から得ることができる。CD34+細胞はヒトUCBにおける全単核細胞(MNC)の0.02%から1.46%を構成するのに対し、その割合は骨髄で0.5%から5.3%の間で変化し、末梢血7、8、9では〜0.01%とはるかに低い。 .UCB由来CD34+細胞の増殖能力および分化電位は、骨髄または末梢血細胞1、10のそれよりも有意に高く、それによって得られる明確な利点を提供する分化中の細胞の免疫発知性および形態学的特徴付けを行うことと組み合わせて分子解析に十分な材料。
臍帯血由来CD34+HSPCの外生分化は、正常な血清症および血統病のメカニズムを調用するための広く適用されたモデルである。適切なサイトカインで培養すると、UCB CD34+ HSPCは、骨髄またはリンパ系系統11、12、13、14、15に沿って分化するように誘導することができる。,16.ここでは、ヒトUCBからのCD34+HSPCの単離および免疫表現性特性、および骨髄系統細胞への分化のためのプロトコルについて説明する。この培養システムは、骨髄の微小環境を模倣するMS-5間質細胞の存在下でのHSPCのサイトカイン誘導分化に基づいている。培養条件は、CD34+細胞の初期増殖を引き起こし、続いて4つの骨髄系統細胞、すなわち顆粒球細胞(CD66b)、単球(CD14)、巨核球(CD41)、および、および4つの骨髄系統細胞のマーカーを発現する細胞への分化を引き起こす。赤血球(CD235a)。CD34+細胞分化プロトコルの応用には、血化を調節する分子機構に関する研究、および自己再生に伴う骨髄性疾患および小分子の影響の調査およびHSPC の差別化。
Protocol
実験のためのヒト臍帯血は、フェニックスのマリコパ統合保健システム(MIHS)にインフォームドコンセントの後、健康な個人によって寄付されました。識別されなかったユニットは、MIHSとアリゾナ大学との間の材料移転契約を通じて取得されました。 1. 試薬とバッファー 注:生物学的安全キャビネット内の無菌条件下ですべての試薬および?…
Representative Results
上記のプロトコルの適用は、〜100 mLの臍帯血単位から5.6(±0.5)x 108 MNCおよび1(±0.3)x 106 CD34+細胞を生み出す。CD34+セルの合計のパーセンテージは、80 ~ 90% の範囲です (図 2A,B)。Manz et al.5で説明したスキームによる免疫発フェノチピック分析は、CD34+細胞が通常、Lin – /CD34+/CD38-およびLin <su…
Discussion
ここで説明するプロトコルは、UCB由来CD34+HSPCの4つの骨髄系統の生体分化に適している。SCF、TPO、Flt3LおよびIL3からなるサイトカインミックスを用いた初期インキュベーションは、CD34+細胞を刺激する。その後、SCF、IL3、Flt3L、EPO、およびTPOのカクテルで差別化が達成されます。この組み合わせでは、SCF、IL3、およびFlt3Lは、CD34+HSC.EPOおよびTPOがそれぞれ赤血球および巨核球に対…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ウェンディ・バレット、レイチェル・カバレロ、マリコパ統合医療システムのガブリエラ・ルイスに対して、コード血液ユニットの識別と寄付を行った、Mrinalini Kalaのフローサイトメトリーの支援、ゲイ・クルックスとクリストファー・シートに感謝したいと思います。ex vivo骨髄分化に関するアドバイス。この研究は、国立衛生研究所(R21CA170786およびR01GM127464)と米国癌学会(機関研究助成金74-001-34-IRG)からのS.S.への資金によって支援されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
Referências
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
Citar este artigo
Bapat, A., Keita, N., Sharma, S. Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (150), e59836, doi:10.3791/59836 (2019).