1. Programmering for automatisert væskebehandling Opprett en ny metode fra Fil-menyen (Fil | Ny metode)MERK: Fullfør trinnene i den angitte rekkefølgen. Den kursike skriften betegner tekst som skal skrives inn i Biomek-programvaren. Ta kontakt med forfatterne for informasjon om pipetteringsteknikker og maler. Skriv inn Start trinnvariabler og verdiene i starttrinnet som er oppført i tabell 1. Angi kolonner for selektiv tupppiptting. For trinnene 1.3-1.7 klikker du på Angi globalt trinn på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar det til metoden. Ved hjelp av set global trinn, angi verdi = FirstColumn til variabel FirstColumn_Global, verdi = LastColumn til variabel LastColumn_Global, verdi = LastColumn-FirstColumn + 1 til variabel kolonner, og verdi = Kolonner * 8 til variabel Brønner. Velg skripttrinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn VB-skriptet som angitt i figur 2. Innstilling av volumer for mikser Set Global og løsninger. Bruk trinnet Angi globalt til å angi de tilsvarende verdiene til volumblandingsvariablene som vist i tabell 2. Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Under betingelser skriver du inn Autosampler. Under Deretterklikker du angi globalt trinn på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Ved hjelp av angi globalt trinn, angi verdi =(MobilePhase * Kolonner)+10 til variabel MobilePhaseWell. Klikk Angi globalt trinn på verktøylinjen under Kontrolltrinn under Else,og dra det til metoden. Ved hjelp av set global trinn, angi verdi = 0 til variabel MobilePhaseWell Konfigurere guidet labware oppsett (GLS) Klikk på Deck Editor-trinnet på verktøylinjen under Verktøy. Lag et nytt deck for å korrespondere med dekkoppsettet i figur 3 og merk det som dekk 1. Klikk trinnet Veiledet oppsett på verktøylinjen under Oppsett og enheter, og dra det til metoden. Dra og slipp labware-typene i dekksposisjonene som angitt i tabell 3. Deretter fyller du fanene i tabellen som vist i tabell 3 og figur 4 (Konfigurere det veiledede oppsettet). Definere prosedyre for tipstelling Klikk trinnet Definer prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navneprosedyre som TipCount. Klikk skripttrinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn VB-skriptet som angitt i figur 5 (skript for tipstelling). Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Under betingelser skriver du inn TL5 = 0. Under Deretterklikker du på Flytt Labware-trinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og drar det til metoden. Flytt labware fra TL5 til TR3. Klikk trinnet Flytt Labware på verktøylinjen under Trinn for oppsett og enhet, og dra det til metoden. Flytt labware fra TL2 til TL5. Til slutt klikker du på Flytt Labware-trinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn og drar det til metoden. Flytt labware fra BC90 til TL2. Definere prosedyre for inkubator Klikk trinnet Definer prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navnprosedyre som inkubator. Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardverdi. Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 22 som standardverdi. Skriv inn temp som variabelnavn og 60 som standardverdi. Klikk trinnet Forbedret Move Labware på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Flytt labware fra P11 til INHECO1. Klikk trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navneprosedyre som TipCount. Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk enheten i posisjon, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C med måltemperatur. Velg alternativet Rist under inkubering og Orbital (med klokken)rist stil. For innstillinger skriver du inn 1,00 mm fra side til side, 6,6 ganger i sekundet, 1,00 mm fremover annonsen bakover og 6,6 ganger i sekundet.MERK: Kontroller at INHECO Inkubatorprogramvaren er installert. Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk enheten i posisjon, =HalfTime for Incubate for, =Temp for °C og 3 for °C med måltemperatur. Velg alternativet Rist under inkubering og Orbital (Mot klokken)rist stil. For innstillinger skriver du inn 1,00 mm fra side til side, 6,6 ganger i sekundet, 1,00 mm forover og bakover med 6,6 ganger i sekundet. Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Sett hele systemet på pause i 1 s. Klikk trinnet Definer prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Navnprosedyre som inkubator. Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk apparatet i posisjon, 1 for inkubat for, =NextTemp for °C og 3 for °C med måltemperatur. Definere prosedyre for Orbital. Klikk trinnet Forbedret Move Labware på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Flytt labware fra P11 til Orbital1. Klikk trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra den til metoden. Velg prosedyre TipCount. Klikk på enhetshandling-trinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Velg Device OritalShaker0, Command TimedShake. Angi Risting hastighet 1000, Tid for å nå full hastighet 2, Tid for å riste 30. Klikk trinnet Forbedret Move Labware på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Flytt labware Orbital1 til P11. Sette opp den første blandingen Klikk velg tips trinn på verktøylinjen under Flytende håndtering trinn og dra den til metoden. Velg omorganisere posisjon TL4. Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Skriv inn INHECO1 for bruk apparatet i posisjon, 1 for inkubat for, 60 for °C og 3 for °C med måltemperatur. Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som slutt og 1 som økning. Klikk trinnet Velg tips innlastingstips på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =FirstMix, Aspirer i kolonne 1 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =FirstMix, dispenser på kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkketrinn. Velg Utlastingstips til TR1. Sette opp prøvene Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn SamplePlate som betingelse. Under Deretterklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn =tipcolumns. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Greiner96RoundPS Labware Type and Samples Position. Skriv inn volum =Eksempel, Aspirer på kolonne = FirstColumn og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplateposisjon. Skriv inn volum =Eksempel, dispenser på kolonne = FirstColumn og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1. Når du er på slutten av Hvis-trinnet, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. If Velg inkubator for prosedyre. Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 1800 som standardverdi. Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 22 som standardverdi. Skriv inn temp som variabelnavn og 60 som standardverdi. Sette opp Cysteine-blokken Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning. Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =CysteineMix, aspirer i kolonne 2 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplate posisjon. Type i volum = CysteineMix, dispensere i kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1. Når du er på slutten av Hvis-løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg inkubator for prosedyre. Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 300 som standardverdi. Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 43 som standardverdi. Skriv inn temp som variabelnavn og 25 som standardverdi. Sette opp den andre blandingen Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning. Under løkke klikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn og drar den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =SecondMix, Aspirer i kolonne 3 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplateposisjon. Skriv inn volum = SecondMix, Dispenser ved kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1. Når du er på slutten av Hvis løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg prosedyre Orbital. Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Sett hele systemet på pause i 1 s. Sette opp Trypsin-tillegg Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning. Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =Trypsin, Aspirer i kolonne 4 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplateposisjon. Skriv inn volum =Trypsin, Dispenser på kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, innen da. Velg Utlastingstips til TR1. Når du er på slutten av Hvis-løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg inkubator for prosedyre. Skriv inn HalfTime som variabelnavn og 3600 som standardverdi. Skriv inn NextTemp som variabelnavn og 25 som standardverdi. Skriv inn temp som variabelnavn og 43 som standardverdi. Klikk inheco inkubat-trinnet på verktøylinjen under Integrasjoner, og dra det til metoden. Kontroller at INHECO Inkubatorprogramvaren er installert. Skriv inn INHECO1 for bruk apparatet i posisjon, 1 for inkubat for, 25 for °C og 5 for °C med måltemperatur. Sette opp slukking Klikk Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i Velg tipstrinn. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning. Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum = Slukk, Aspirer i kolonne 5 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplate posisjon. Skriv inn volum =Slukk, Dispenser ved kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i Deretter. Velg Utlastingstips til TR1. Når du er på slutten av Hvis løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg prosedyre Orbital. Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Sett hele systemet på pause i 1 s. Klikk pausetrinnet på verktøylinjen under Oppsett og enhetstrinn, og dra det til metoden. Velg Sett hele systemet på pause, og vis denne meldingen. Skriv inn meldingen “Fortsett etter sentrifugering”. Sette opp platen for Autosampler Klikk Hvis-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden, i velg tips-trinnet. Select Tip Skriv autosampler som betingelse. Klikk Then deretter Løkke-trinnet på verktøylinjen under Kontrolltrinn, og dra det til metoden. Skriv inn col som variabel =FirstColumn som Start, =LastColumn som Slutt og 1 som økning. Under Løkkeklikker du trinnet Velg tips laster inn på verktøylinjen under Flytende håndteringtrinn, og dra den til metoden. Velg BC230 Tips, TL6 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn 1. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reagensplateposisjon. Skriv inn volum =MobilePhase, Aspirer i kolonne 6 og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv inn volum =MobilePhase, Dispenser ved kolonne = col og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i Deretter. Velg Utlastingstips til TR1. Når du er på slutten av Hvis-løkken, klikker du trinnet Kjør prosedyre på verktøylinjen under Kontrolltrinn og drar den til metoden. Velg prosedyre TipCount. Klikk trinnet Velg tips innlastingstips på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra den til metoden. Velg BC90 Tips, TL5 Plassering og TL2 backup Tips Plassering fra rullegardinmenyen. Velg Enkeltkolonne(er) og skriv inn =tipcolumns. Klikk trinnet Velg tipsaspirer på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden i løkken. Velg BCDeep96Round Labware Type og Reaksjonsplate posisjon. Skriv inn volum =DigestTransfer, Aspirer på kolonne = førstekolonne og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips Dispenser på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden, i løkken. Velg Bio_RadPCR96 Labware Type og Autosampler Plate Position. Skriv inn volum =MobilePhase, Dispense på kolonne = FirstColumn og rad 1. Velg en optimalisert teknikk fra rullegardinmenyen for teknikk. Klikk trinnet Velg tips utlasting på verktøylinjen under Flytende håndteringstrinn, og dra det til metoden i Deretter. Velg Utlastingstips til TR1. Velg tipstrinnet slutter her. Lagre og gi metoden et navn. 2. Klargjør prøve,labware og reagenser Overfør 5 μL samlet sunt humant plasma til en polypropylen, 96-runde deep well plate.MERK: Se materialtabellen for reagenser og forsyninger som brukes i denne protokollen. TPCK Behandlet Trypsin ble kjøpt og trypsin til substrat ratio og inkubasjontid ble optimalisert spesielt. Hvis en annen karakter av trypsin brukes, for eksempel sekvensklasse rekombinant trypsin, bør enzymet til substratforholdet og inkubasjonstiden testes og optimaliseres. 3. Prosedyre for drift Dobbeltklikk på programvareikonet. Under Kategorien Metode velger du Hjem alle akser for å orientere og klargjøre den automatiserte væskebehandleren. Sørg for at alle arbeidsstasjonssprøyter ikke inneholder synlige luftbobler. Velg FileÅpne | Metode. Velg metoden (Figur 6). Start metoden ved å klikke på Run det grønne trekantformede Kjør-ikonet. Hvis du vil at en autosamplerplate skal klargjøres på slutten av metoden, angir du verdien “sann” i ledeteksten Angi en verdi som skal brukes for “Autosampler”, og deretter klikker du OK. Hvis en autosamplerplate ikke blir klargjort, angir du verdien ‘false’, og deretter klikker du OK. Angi verdien ‘1’ i angi en verdi som skal brukes for ‘firstcolumn’-ledeteksten, og klikk deretter OK. Angi verdien ’12’ i angi en verdi som skal brukes for ‘lastcolumn’ prompt, og klikk deretter OK.MERK: Dette trinnet og trinn 4.7 ber arbeidsstasjonen om å utføre en fordøyelse på 12 kolonner med en 96-brønnplate, noe som resulterer i at alle brønnene på platen brukes til fordøyelsen Hvis en prøveplate brukes med prøvevolumer på minst 20 μL, angir du verdien “sann” i ledeteksten Angi en verdi som skal brukes for “SamplePlate”, og deretter klikker du OK. Hvis en eksempelplate ikke brukes, angir du verdien ‘false’, og deretter klikker du OK.MERK: Hvis en prøveplate ikke brukes, tilsett 5 μL prøve til hver tilsvarende brønn i reaksjonsplaten. Følg instruksjonene i vinduet Guided Labware Setup , og klikk på Fortsett.MERK: Det neste vinduet beskriver oppsettet for “Reagensplaten” som skal klargjøres (figur 7 , tilleggstabell 1). Følgende volumer vil bli sitert inn i hver av de 8 brønnene i en enkelt kolonne i 1 ml Deep Round 96-brønnplate:Kolonne 1: 540 μL reaksjonsblanding 1.Kolonne 2: 50 μL cysteinblokk.Kolonne 3: 730 μL reaksjonsblanding 2.Kolonne 4: 130 μL Trypsin.Kolonne 5: 130 μL slukkeløsning.Kolonne 5: 1090 μL mobilfaseløsning (hvis brukeren gikk inn i “sann” i trinn 6). Klikk Neste, og følgende vindu beskriver minimumsvolumet (20 μL) som trengs for å bli lagret i prøveplaten. Hvis brukeren har angitt verdien “false” for ledeteksten som involverer prøveplaten (trinn 9), blir brukeren bedt om å legge til 5 μL-prøve i reaksjonsplaten. Klikk Neste.MERK: Det neste vinduet viser at en tom 90 μL-tip-boks må plasseres på det automatiserte væskebehandlingsaggregatet. Klikk Neste igjen, legg ut den automatiserte væskebehandlerens dekk som spesifisert og illustrert (Figur 8) inkludert reagensplaten, reaksjonsplaten, prøveplaten, autosamplerplaten, 6 hele 90 μL-tipbokser, en tom 90 μL-tip-boks og en full 230 μL-tipboks. Klikk Fullfør for å starte metoden.MERK: Etter å ha klikket Fullfør, kan ikke brukeren nå inn i den automatiserte væskebehandleren. Dette vil “bryte lysgardinen” på maskinen og stoppe væskehåndtereren som en sikkerhetsforanstaltning. Ved fortsett etter sentrifugering sentrifugering, hente reaksjonsplaten og sentrifuge den i 30 minutter ved 3000 rpm. Når sentrifugeringen er fullført, returnerer du reaksjonsplaten til den automatiserte væskebehandleren til den posisjonen den var i før sentrifugeringen, og klikker fortsett.MERK: Den automatiserte væskebehandleren stopper igjen når metoden er fullført. Hvis brukeren skrev inn “true” for trinn 6, kan autosamplerplaten deretter fjernes fra arbeidsstasjonen og plasseres i autosampleren til et flytende kromatografiinstrument for analyse. 4. LC-MSMS Løs peptider på en høy strømning HPLC bestående av en C18 2,1 mm x 100 mm, 3,5 μm kolonne med en strømningshastighet på 0,25 ml / min og analysert inline på en trippel quadrupole massespektrometer.MERK: Etter fordøyelsen peptid er den målrettede LC-MSMS-metoden for å kvantifisere peptider fra robotforberedte prøver beskrevet i detalj1 etter en kort beskrivelse av LC-MSMS. Sett søyleovnstemperaturen til 40 °C. Bruk buffer A (2 % ACN, 98 % vann, 0,1 % maursyre) og buffer B (95 % ACN, 5 % vann, 0,1 % maursyre) som de to mobile fasene. Likevekten kolonnen med 5 % B i 5 minutter etter lasting. Elute peptidene over 30 minutter med en lineær 5% til 35% gradient av buffer B. Resirkuler kolonnen før du laster neste prøve ved å vaske med 98% B i 10 minutter og deretter 5% B i 5 minutter. For on-line avledning, avlede post-kolonne eluent til avfall før den kom inn i ion kilden ved hjelp av en to-fase vekslingsventil. Behandle MRM-dataene.