פרוטוקול להכין תרביות פרוסות חופשיות מן המוח האנושי המבוגר מוצג. הפרוטוקול הוא וריאציה של שיטת תרבות הפרוסה הנפוצה בשימוש באמצעות מוסיף ממברנה. זה פשוט, חסכוני, ומומלץ להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של נוירוניוון מאחורי הגיל הקשורים מחלות המוח.
תרבויות אורגנוטיפקס, או פרוסות, הועסקו באופן נרחב בהיבטים של מערכת העצבים המרכזית הפועלת בתחומי החוץ הגופית. למרות הפוטנציאל של תרבויות הפרוסה במדעי המוח, מחקרים המשתמשים ברקמת העצבים הבוגרת כדי להכין תרבויות כאלה עדיין נדירים, בעיקר אלה מתוך הנתינים האנושיים. השימוש ברקמת האדם המבוגר להכנת תרבויות הפרוסה אטרקטיבי במיוחד כדי לשפר את ההבנה של הנוירולוגיה האנושית, כאשר הם מחזיקים במאפיינים ייחודיים האופייניים למוח האנושי הבוגר חסר בפרוסות מכרסמים (בדרך כלל בעלי חיים) רקמת העצבים פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ברקמת המוח שנאספו מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מחדש כדי להכין את התרבויות לטווח קצר, בחינם צף תרביות פרוסה. הליכים לתחזוקה וביצוע ביולוגיה ביוכימית ובביולוגיה סלולרית מוצגים גם הם. התוצאות הייצוגיות מדגימות כי הדבקת קליפת הגוף האנושית הטיפוסית נשמרת בפרוסות לאחר 4 ימים במבחנה (DIV4), עם הנוכחות הצפויה של סוגי התא העצבי הראשי. יתר על כן, פרוסות ב DIV4 לעבור מוות תאים חזקים כאשר מאותגרים עם גירוי רעיל (H2O2), המציין את הפוטנציאל של מודל זה לשמש פלטפורמה במוות תאים assays. שיטה זו, חלופה פשוטה וחסכונית לפרוטוקול בשימוש נרחב באמצעות מוסיף ממברנה, מומלץ בעיקר להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של ניוון שמאחורי הגיל מחלות המוח הקשורות. לבסוף, למרות הפרוטוקול מוקדש באמצעות רקמה קורטיקלית שנאסף מחולים שהוגשו טיפול כירורגי של אפילפסיה האונה הרקתית הטמפורלית, זה נטען כי הרקמה שנאספו מאזורים אחרים במוח/תנאים צריך גם להיות נחשבים למקורות להפקת תרביות פרוסה חופשיות דומות.
השימוש בדגימות אנושיות במחקר הוא באופן חד-משמעי אפשרות גדולה ללמוד פתווגיות המוח האנושי, טכניקות מודרניות פתחו דרכים חדשות לניסויים חזקים ומוסריים באמצעות רקמת החולה הנגזר. שיטות כמו תרבויות אורגאוטימית/פרוסה שהוכנו ממוח אנושי מבוגר שימשו יותר ויותר בתבניות כגון אלקטרואופטיקה1, אלקטרופיזיולוגיה2,3,4,5, פלסטיות 6,7,8,9, רעילות נוירו/הגנהעצבית 10,11,12,13, טיפול בתאים14, הקרנת סמים15,16,17, גנטיקה, ועריכת גנים12,18,19,20, בין היתר, כאסטרטגיה לטוב יותר הבנת מחלות נוירולוגיות במהלך הבגרות.
הבנת המנגנונים המשמשים לפתווגיות המוח האנושי תלויה באסטרטגיות נסיוניות הדורשות מספר רב של נושאים. לעומת זאת, במקרה של תרבויות פרוסה, למרות הגישה לדגימות אנושיות עדיין קשה, את האפשרות של הפקת עד 50 פרוסות ממדגם קליפת גוף אחת באופן חלקי הדרישה של גיוס מתנדבים מרובים על ידי הגדלת ה מספר המשכפלת והביצוע המתבצע לפי רקמה21.
מספר פרוטוקולים לתרביות ממוח/פרוסה מתוארים, החל בטיוטות קלאסיות של האוליים22,23 לצינור רולר24,25,26, ממברנות למחצה , ממשק27,28,29,30. ופרוסות חופשיות31,32 בהתאם לקצוות של תכנון ניסיוני, לכל טכניקה יש יתרונות וחסרונות משלה. לטווח קצר, תרבויות חופשיות צפה מהמוח האנושי הוא במקרים מסוימים יתרון על השיטה בשימוש על ידי Stoppini ואח ‘27, אם בהתחשב בעובדה כי למרות הישרדות תאים ארוכי טווח בתוך מבחנה היא בדרך כלל דאגה עיקרית בעת הערכת שיטת תרבות, בניסויים רבים רק פרקי זמן קצרים בתרבות נדרשים12,31,32,33,34,35. בתנאים אלה, השימוש בתרבויות חופשיות-צף מציג את היתרון של להיות פשוט יותר וחסכוני יותר, כמו גם מדויק יותר הדומה למצב רקמת האדם המקורי מאשר פרוסות שנשמרו בתרבות במשך 2-3 שבועות.
למרות הפוטנציאל של תרבויות הפרוסה למדעי המוח, מחקרים המשתמשים ברקמת העצבים הבוגרת להכנת התרבויות הללו עדיין נדירים, בעיקר מנושאים אנושיים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתמש ברקמת המוח שנאסף מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מחדש כדי להכין תרבויות הפרוסה צף חופשי. הליכים לתחזוקה ולביצוע ביולוגיה ביוכימית ובביולוגיה תאית מפורטים באמצעות התרבויות הללו. פרוטוקול זה הוכח ערך לניתוח כדאיות ותפקוד עצבי בחקירות על מנגנונים של נוירופתוגיות המקושרים לבגרות.
פרוטוקול זה להפקת תרבות פרוסה בחינם, לטווח קצר, היא שיטה חלופית לפרוסות בוגרות של האדם האנושי. פרוטוקול כזה עבור תרבויות פרוסה עשוי להיות קל למחקרים על (אבל לא מוגבל) אלקטרואופטיקה1,44,45, אלקטרופיזיולוגיה2,3<su…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי FAPESP (גרנט 25681-3/2017 ל-AS), גלימות (פוסט דוקטורט מלגת PNPD/INCT-HSM כדי A.F. ו-דוקטורט מלגת N.D.M.) ו FAEPA. G.M.A. מחזיקה מלגת מאסטר מ FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. מחזיקה מלגת מחקר CNPq. אנו מודים למטופלים ולמשפחותיהם על תרומת הרקמה החוזרת למחקר זה. היינו רוצים להכיר בתמיכה של תושבים, אחיות, טכנאים, וצוות CIREP, מבית החולים הקליני בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו, אוניברסיטת סאו פאולו, מי עזר בשלבים שונים של התהליך.
2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
TEMED | GE | 17-1312-01 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
Equipment and Material | |||
24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
Motorized pestle | Kimble Chase | ||
Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
Vibratome | Leica | 14047235612 – VT1000S | |
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 – ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
Entellan | Merck | 107960 | |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |