Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados

Summary

As contrações uterinas são importantes para o bem-estar das fêmeas. No entanto, a contratilidade patologicamente aumentada pode resultar em dismenorreia, especialmente em fêmeas mais jovens. Aqui, nós descrevemos uma preparação ex vivo simples permitindo a avaliação rápida da eficácia de afrouxamento do músculo liso que podem ser usados tratando o dysmenorrhea.

Abstract

A dismenorreia, ou cãibras dolorosas, é o sintoma mais comum associado à menstruação em fêmeas e sua gravidade pode dificultar a vida cotidiana das mulheres. Aqui, apresentamos um método fácil e barato que seria instrumental para testar novas drogas diminuindo a contratilidade uterina. Este método utiliza a habilidade original do intervalo reprodutivo do rato inteiro para expor a motilidade espontânea quando mantido ex vivo em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Esta motilidade espontânea assemelha-se à atividade myometrial onda-como do útero humano, referido como ondas endometrial. Para demonstrar a eficácia do método, empregamos um bem conhecido medicamento relaxante uterino, epinefrina. Nós demonstramos que a motilidade espontânea do intervalo reprodutivo do rato inteiro pode ser rapidamente e reversivelmente inibida pela epinefrina de 1 μM neste modelo do prato de Petri. Documentar as mudanças da motilidade uterina pode ser facilmente feito usando um telefone inteligente comum ou uma câmera digital sofisticada. Nós desenvolvemos um algoritmo MATLAB-baseado permitindo o seguimento do movimento para quantificar mudanças uterine espontâneas da motilidade medindo a taxa de movimentos uterine do chifre. Uma grande vantagem dessa abordagem ex vivo é que o trato reprodutivo permanece intacto durante todo o experimento, preservando todas as interações celulares intrauterinas intrínsecas. A principal limitação dessa abordagem é que até 10-20% dos úteros podem não apresentar motilidade espontânea. Até o momento, este é o primeiro método quantitativo ex vivo para avaliar a motilidade uterina espontânea em um modelo de prato de Petri.

Introduction

Como um órgão fêmea principal, o útero é crucial para a reprodução e essencial para a nutrição do feto¹. O útero consiste em três camadas: o perimetrium, o miométrio e o endométrio. O miométrio é a camada contrátil principal do útero e joga um papel chave na entrega do feto. O endométrio é a camada mais interna que reveste a cavidade uterina e é essencial para a implantação do embrião. Em fêmeas não gestantes em idade reprodutiva, a camada endometrial é vertida mensalmente no início do ciclo menstrual. O miométrio auxilia neste processo de derramamento, mantendo as contrações miometrial espontâneas necessárias para limpar o tecido endometrial necrótico do útero¹.

Infelizmente, aumento da contratilidade miometrial pode resultar em efeitos colaterais negativos, tais como dismenorreia, ou cãibras menstruais dolorosas. Isto é especialmente observado em fêmeas jovens e mulheres nulíparas². No entanto, a dismenorreia é diferente para cada mulher e depende da força de suas contrações miometrial; as contrações mais fortes são frequentemente associadas com a sensação de cãibras severas³. A contratilidade miometrial pode ser visualizada usando ultrassonografia uterina e muitas vezes é reconhecida como ondas endometriais. A liberação aumentada das prostaglandinas durante a menstruação⁴ em um útero que submete-se a descamação endometrial é acreditada para contribuir ao hypercontractility myometrial aumentado, tendo por resultado a isquemia e o hipóxia do músculo uterine e aumentado assim dor³.

Dismenorreia severa pode dificultar a atividade do dia-a-dia de algumas mulheres e 3 a 33% das mulheres têm dor muito severa, o que poderia causar uma mulher a ser acamados por 1 a 3 dias cada ciclo menstrual⁵. A dismenorreia é a principal causa de morbidade ginecológica em mulheres em idade reprodutiva, independentemente da idade, nacionalidade e status econômico⁵. A prevalência estimada de dismenorreia é alta e variável, variando de 45% a 93% em mulheres em idade reprodutiva⁵.  A dor associada à dismenorreia tem efeito no cotidiano das mulheres e pode resultar em mau desempenho acadêmico em adolescentes, menor qualidade de sono, restrição de atividades diárias e alterações de humor⁵.

Muitas mulheres que experimentam dismenorreia grave recorrer a medicamentos over-the-counter para aliviar a sua dor. Tais medicamentos de balcão contêm inibidores da ciclooxigenase (COX) que impedem a formação de prostaglandinas⁶. No entanto, os inibidores da COX estão associados a eventos cardiovasculares adversos, e cerca de 18% das mulheres com dismenorreia não respondem a esses inibidores⁷. Portanto, há uma necessidade de novos medicamentos para reduzir as cólicas menstruais. Desde que sobre o contratilidade do útero contribui à patogénese do dysmenorrhea, uma estratégia possível pode ser o uso de relaxants uterine.

É benéfico quantificar os efeitos de drogas relaxantes potenciais em um modelo de ocorrência natural myometrial espontâneo-como contrações de onda. Entretanto, assim distante, nenhum método ex vivo eficiente para testar drogas músculo-relaxando no útero intacto foi descrito. Atualmente, medições de tensão isométrica são usadas para avaliar os efeitos de drogas relaxantes. Durante tais medidas, uma tira do músculo uterine é mantida em um comprimento constante a pré-carga em um banho do tecido quando a força de contrações do músculo uterine for gravada antes e depois da estimulação do ocitocina na presença ou na ausência de uma droga relaxante. Embora esta aproximação seja muito útil, exige o equipamento caro. Além disso, as contrações isométricas não se assemelham às contrações myometrial espontâneas da onda-como que ocorrem naturalmente no útero intacto. Excepcionalmente, as ondas myometrial uterine nos roedores podem ser visualizadas como a motilidade uterine do chifre quando o intervalo reprodutivo inteiro (ovários, oviducts, útero, e vagina) é mantido em uma solução do amortecedor. Aqui, nós apresentamos um método ex vivo para monitorar a motilidade espontânea do útero intacto do rato coloc em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Também descrevemos um algoritmo de quantificação da motilidade utilizando o rastreador de movimento MATLAB. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos dispendiosa para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente e compostos sintéticos.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade de Indiana (Indianapolis, IN). 2-5 mês-velho F2-129S-C57BL/6 ratos fêmeas sexualmente maduros foram utilizados no estudo. Atenção: Assegure a segurança desgastando um revestimento, uma máscara, e umas luvas do laboratório ao trabalhar com animais e materiais bioperigosos. 1. preparação da soluçã…

Representative Results

A Figura 1 mostra imagens representativas tiradas durante todo o procedimento de isolamento do trato reprodutivo descrito neste protocolo. Para evitar contaminar o tampão com pêlo, o que diminuiria a qualidade do vídeo, umedecido o corpo do mouse com 70% de etanol. A principal referência para a seção de dissecção do protocolo é encontrar a bexiga urinária. O útero ea vagina será localizado inferior à bexiga urinária. Para testar o protocolo, tratamos…

Discussion

Aqui, descrevemos um método para avaliar a contratilidade espontânea de todo o trato reprodutivo de roedores, que inclui os ovários, ovidutos, chifres uterinos e a vagina. Utilizou-se um método semelhante para demonstrar o efeito relaxante da fenilefrina na motilidade uterina espontânea¹³, porém, no passado não pudemos fornecer análise quantitativa dos dados. Neste trabalho, desenvolvemos um algoritmo para análise quantitativa de dados de motilidade utilizando o módulo de rastreamento de…

Materials

Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2– 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later