גן ישיר לנקוש-החוצה של חוט השדרה בתאי גזע עצביים באמצעות אלקטרופורציה של CAS9 חלבון-gRNA מכלולי
Summary
הציג כאן הוא פרוטוקול לבצע זמן, שטח הגן מוגבל להוריד במיתרי השדרה על ידי הזרקת CAS9-gRNA מורכבות לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation.
Abstract
האקסון יש את היכולת הייחודית להתחדש באופן מלא בחוט השדרה שלה. זה בעיקר בשל התאים הependymal שנותרו כמו תאי גזע עצביים (NSCs) ברחבי החיים, אשר מתרבים לרפורמה הצינור ependymal ולהבדיל לתוך הנוירונים איבד לאחר פגיעה בחוט השדרה. פענוח כיצד NSCs אלה לשמור על העוצמה לאחר הפיתוח ומתרבים על הפגיעה בחוט השדרה לרפורמה מבנה טרום פציעה המדויק יכול לספק תובנה רבת ערך לגבי האופן שבו מיתרי השדרה יכול להתחדש כמו גם אפשרויות טיפול פוטנציאליות. ביצוע המנקוש גנים בקבוצות מערכות מסוימות של NSCs בתוך פרק זמן מוגבל יאפשר לימוד של מנגנונים מולקולריים מאחורי אלה תהליכי רגנרציה, מבלי להיות מבולבל על ידי פיתוח perturbing אפקטים. מתוארים כאן היא שיטה לבצע גנים מעלף בחוט השדרה NSCs באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. על ידי הזרקת את קומפלקס CAS9-gRNA לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation, היעד גנים הם הפילו בתוך NSCs באזורים ספציפיים של חוט השדרה בנקודת זמן רצויה, המאפשר מחקרים מולקולריים של חוט השדרה NSCs במהלך תחדשות.
Introduction
חוט השדרה של רוב החוליות אינו מסוגל להתחדש בעקבות פציעה, המוביל נכות קבע. מספר מסלמנדרות, כגון האקאוסול, הם חריגים בולטים. האקסון יכול להתחדש באופן מלא בחוט השדרה זהה מבחינה מבנית ותפקוד שחזור לחלוטין חוט השדרה. הרבה יכולת ההתחדשות של חוט השדרה האקאולית היא בשל תאים ependymal. תאים אלה קו התעלה המרכזית, ובניגוד לאלה יונקים, התאים axoependymal l להישאר כתאי גזע עצביים (NSCs) לאחר ההתפתחות העובריים. לאחר פגיעה בחוט השדרה (למשל, מ קטיעה זנב), אלה NSCs מתרבים לגדול מחדש את צינור ependymal ולהבדיל להחליף נוירונים אבודים1,2,3. חשיפת כיצד axoNSCs חוט השדרה להישאר pluripotent ולהיות מופעל לאחר הפציעה יכול לספק מידע חשוב על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות עבור חולים אנושיים.
בשל ההתקדמות ב-crispr-Cas9 gene הטכניקה, ביצוע טוק-אאוט כדי לפענח את הפונקציה גנטית הפכה קלה יותר, הוכח כי יש ישימות רחבה במינים שונים, כולל axo ls4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. המהדורה האחרונה של הגנום axoלגמרי למלא וטראנסקריפט כעת מאפשר לכל מקום גנומית להיות ממוקד ולהעריך טוב יותר את ההשפעות מחוץ ליעד9,10,11,12 , מיכל בן 13 , 14. ממוטב הפרוטוקולים פותחו עבור לנקוש-out ו-in ב axoCas9 ls באמצעות CRISPR-מערכת15. משלוח של מכונות CRISPR-Cas9 בצורה של חלבון CAS9-gRNA ribonuאופאנפרוטאין (RNP) הוכח להיות יעיל יותר מאשר באמצעות Cas9 ו-gRNA-קידוד פלמידים4. זה סביר בגלל RNP להיות קטן יותר בגודל של וקטורים פלביניים, היכולת שלה ליצור הפסקות DNA מיד, והגנה על gRNA מ-RNA השפלה. בנוסף, באמצעות שימוש עוקף RNPs ותרגום; כך, הוא מונע בעיות כגון כוח היזם ושימוש אופטימלי השימוש כאשר אלמנטים פלביניים נגזרים ממינים שונים.
מחקרים באובדן התפקוד הם אחת הגישות הכלליות לחקירת פונקציות פוטנציאליות של גנים מעניינים. על מנת ללמוד פונקציה גנטית במהלך התחדשות, נוק אאוט צריך להתבצע באופן אידיאלי רק לפני פגיעה כדי למנוע השפעות על פיתוח. בנוסף, הדפיקה החוצה צריכה להיות מוגבלת הן לNSCs והן לאזור ההתחדשות. להפיל את הגן היעד של כל NSCs (כולל אלה במוח, שהוא המקרה במערכות מערכות לloxp), עשוי לייצר אפקטים לא קשור התחדשות שיכול לבלבל את הפרשנות של תוצאות. למרבה המזל, המבנה של חוט השדרה axol מספק הזדמנות ייחודית לזמן ומקום מוגבל לנקוש ב NSCs. רוב חוט השדרה NSCs במגע עם התעלה המרכזית ומהווים את הרוב המכריע של התאים במגע עם תעלת המרכזית16,17. לכן, זריקה של קומפלקס CAS9-grna לתוך התעלה המרכזית, ואחריו electroporation, מאפשר מסירה NSCs חוט השדרה באזור הרצוי בשעה מסוימת4,18,19. פרוטוקול זה מדגים כיצד זה מבוצע, המוביל לתוך חדירה מאוד החוצה בחוט השדרה NSCs. הניתוח שלאחר מכן מבוצעים כדי ללמוד את ההשפעות על התחדשות ועל התנהגות המועצה לבטחון לאומי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר מאפשר הזמן והשטח הגן מוגבלת לנקוש ב NSCs בחוט השדרה axol. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר פילוח ספציפי של NSCs בזמן מוגדר מיקום עם החדירה גבוה. היא מונעת השפעות בלתי רצויות פוטנציאלי שמקורם הגן לנקוש ב NSCs באזורים אחרים כגון המוח המתרחשים בעת שימוש במערכת היצור-LoxP. זה גם מונע השפעות התפתח…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפרופסור אלי מ. טנקה על תמיכתה המתמשכת וארוכת הטווח. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית המדע הטבעי של סין (NSFC) מענק (317716), מחקר החל מענקים מאוניברסיטת דרום סין נורמלי (S82111 ו 8S0109), ו הקרן המדע הפוסט דוקטורט של סין (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referências
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologia do Desenvolvimento. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
