CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 포공에 의해 액소로틀 척수에서 시간 및 공간 제한 유전자 녹아웃을 수행하는 프로토콜입니다.
Abstract
액소로틀은 척수를 완전히 재생할 수 있는 독특한 능력을 가지고 있습니다. 이것은 주로 신경 줄기 세포로 남아 있는 ependymal 세포 때문 (NSC) 일생 내내, 이는 ependymal 관을 개혁하고 척수 손상 후에 분실한 신경으로 분화하기 위하여 증식합니다. 이러한 NSC가 개발 후 다능성을 유지하고 정확한 사전 손상 구조를 개혁하기 위해 척수 손상 시 증식하는 방법을 해독하면 포유류 척수가 재생되는 방법과 잠재적인 치료 옵션에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 제한된 기간 내에 NSC의 특정 하위 집합에서 유전자 녹아웃을 수행하면 개발 교란 효과에 의해 혼동되지 않고 이러한 재생 프로세스 뒤에 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 여기서 설명된 것은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 축색척수 NSC에서 유전자 녹아웃을 수행하는 방법이다. CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 천공에 이어 표적 유전자는 원하는 시점에서 척수의 특정 영역 내의 NSC에서 기절하여 척수 NSC의 분자 연구를 가능하게 합니다. 재생.
Introduction
대부분의 척추동물의 척수는 상해를 입고 재생할 수 없으므로 영구적인 장애를 초래합니다. 액소로틀과 같은 몇몇 도롱뇽은 주목할 만한 예외입니다. 액소로틀은 구조적으로 동일한 척수를 완전히 재생하고 척수 기능을 완전히 회복시킬 수 있습니다. 액소로틀 척수의 재생 능력의 대부분은 형형세포에 기인한다. 이 세포는 중앙 운하를 일렬로 세게하고, 포유동물에 있는 것과는 달리, axolotl ependymal 세포는 신경 줄기 세포로 남아 (NSC) 배아 후 발달. 척수 손상 후 (예를 들어, 꼬리 절단에서), 이러한 NSCs는 ependymal 관을 재성장하고 잃어버린 뉴런을 대체하기 위해 분화증1,2,3. axolotl 척수 NSC가 다능성으로 남아 있고 부상 후에 활성화되는 방법을 밝히는 것은 인간 환자를 위한 새로운 치료 전략 개발에 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.
CRISPR-Cas9 유전자 녹아웃 기술의 발전으로 인해 유전자 기능을 해독하기 위한 녹아웃 을 수행하는 것이 더 쉬워졌으며 액소로톨 4,5를포함한 다양한 종에서 광범위한 적용 가능성을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 6개 , 7명 , 8. 전체 액소로틀 게놈 및 전사체의 최근 릴리스는 이제 모든 게놈 궤적을 표적으로 하고오프 타겟 효과에 더 나은 평가를 위해 9,10,11,12를 허용합니다 , 13세 , 14. CRISPR-Cas9 시스템15를사용하여 축삭에서 녹아웃 및 녹아웃을 위해 최적화 된 프로토콜이 개발되었습니다. CAS9 단백질-gRNA 리보뉴클레오프로테인트(RNP)의 형태로 CRISPR-Cas9 기계류의 전달은 Cas9 및 gRNA-인코딩 플라스미드4를사용하는 것보다 더 효율적인 것으로 나타났다. 이것은 RNP가 플라스미드 벡터보다 크기가 작고, DNA 를 즉시 생성하는 능력, RNA 분해로부터 gRNA를 보호하기 때문입니다. 또한, RNP를 사용하여 전사 및 번역을 우회; 따라서, 플라스미드 원소가 다른 종으로부터 유래될 때 프로모터 강도 및 최적의 코돈 사용과 같은 문제를 방지한다.
기능 상실 연구는 관심 있는 유전자의 잠재적인 기능을 조사하는 일반적인 접근법 중 하나입니다. 재생 중에 유전자 기능을 연구하기 위해, 녹아웃이상적으로 개발에 미치는 영향을 피하기 위해 부상 직전에 수행해야합니다. 또한 녹아웃은 NSC와 재생 영역 모두에 국한되어야 합니다. 모든 NSCs에서 표적 유전자의 녹아웃(Cre-LoxP 시스템의 경우인 뇌의 유전자 포함)은 결과의 해석을 혼동할 수 있는 재생과 관련이 없는 효과를 생성할 수 있습니다. 다행히도, 액소로틀 척수의 구조는 NSC에서 시간 및 공간 제한 녹아웃을위한 독특한 기회를 제공합니다. 척수 의 대부분은 중앙 운하와 접촉하고 중앙 운하와 접촉하는 세포의 대다수를구성합니다 16,17. 따라서 CAS9-gRNA 복합체를 중앙 운하로 주입한 다음 전기 포출을 한 후 특정 시간 4,18,19에서원하는 부위의 척수 NSC로 전달할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이것이 어떻게 수행되는지 를 보여 주며, 표적 척수 NSC에서 고도로 관통하는 녹아웃으로 이어집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기술된 프로토콜은 액소로틀 척수에 있는 NSC에 있는 시간 및 공간 제한한 유전자 녹아웃을 허용합니다. 현재 프로토콜은 높은 침투와 정의 된 시간과 위치에 NSC의 특정 타겟팅을 할 수 있습니다. 그것은 Cre-LoxP 시스템을 사용할 때 발생하는 뇌와 같은 다른 지역의 CS에서 유전자 녹아웃에서 발생하는 잠재적 인 원치 않는 효과를 방지 할 수 있습니다. 그것은 또한 지속적인 녹아웃에서 유래 하는 개…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
엘리 M. 다나카 교수님의 지속적인 장기적지원에 감사드립니다. 이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (NSFC) 보조금 (317716), 남중국 사범 대학에서 연구 시작 보조금 (S821111 및 8S0109), 중국 박사 후 과학 재단 보조금 (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referências
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