Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9
Summary
Aquí se presenta un protocolo para realizar el desomo genético con tiempo y espacio restringido en las médulas espinales de axolotl inyectando el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación.
Abstract
El axolotl tiene la capacidad única de regenerar completamente su médula espinal. Esto se debe en gran parte a las células ependimales que permanecen como células madre neurales (NSC) a lo largo de la vida, que proliferan para reformar el tubo ependimal y diferenciarse en neuronas perdidas después de una lesión de la médula espinal. Descifrar cómo estos NSC retienen la pluripotencia después del desarrollo y proliferan sobre la lesión de la médula espinal para reformar la estructura exacta antes de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre cómo las médulas espinales de los mamíferos pueden regenerarse, así como posibles opciones de tratamiento. La realización de de knock-outs genéticos en subconjuntos específicos de NSC dentro de un período de tiempo restringido permitirá el estudio de los mecanismos moleculares detrás de estos procesos regenerativos, sin ser confundido por efectos perturbadores de desarrollo. Aquí se describe un método para realizar el knock-out genético en los NSC de la médula espinal axolotl utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Al inyectar el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación, los genes diana se eliminan en los NSC dentro de regiones específicas de la médula espinal en el momento deseado, lo que permite estudios moleculares de los SEN de la médula espinal durante Regeneración.
Introduction
La médula espinal de la mayoría de los vertebrados es incapaz de regenerarse después de una lesión, lo que conduce a una discapacidad permanente. Varias salamandras, como el axolotl, son notables excepciones. El axolotl puede regenerar completamente una médula espinal estructuralmente idéntica y restaurar completamente la función de la médula espinal. Gran parte de la capacidad regenerativa de la médula espinal axololol se debe a las células ependímicas. Estas células recubren el canal central, y a diferencia de las de los mamíferos, las células axolomales ependílicos permanecen como células madre neurales (NSC) de desarrollo postembrionario. Después de una lesión de la médula espinal (por ejemplo, a partir de una amputación de cola), estos SCN proliferan para regenerar el tubo ependimal y diferenciarse para reemplazar las neuronas perdidas1,2,3. Descubrir cómo los NSC de la médula espinal axolotl siguen siendo pluripotentes y se activan después de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para pacientes humanos.
Debido a los avances en la técnica de eliminación del gen CRISPR-Cas9, la realización de noqueos para descifrar la función génica se ha vuelto más fácil y se ha demostrado que tiene una amplia aplicabilidad en varias especies, incluyendo axolotls4,5, 6 , 7 , 8. La reciente publicación del genoma y transcriptoma completos del axolotl ahora permite atacar cualquier locus genómico y evaluar mejor los efectos fuera del objetivo9,10,11,12 , 13 , 14. Se han desarrollado protocolos optimizados para knock-out y knock-in en axolotls utilizando el sistema CRISPR-Cas915. Se ha demostrado que la entrega de la maquinaria CRISPR-Cas9 en forma de ribonucleoproteína CAS9 proteína-gRNA (RNP) es más eficiente que el uso de Plásmidos con codificación Cas9 y gRNA4. Esto es probablemente debido a que el RNP es más pequeño en tamaño que los vectores plásmidos, su capacidad para crear rupturas de ADN inmediatamente, y la protección del ARNR de la degradación del ARN. Además, el uso de RNPs evita la transcripción y la traducción; por lo tanto, evita cuestiones como la fuerza promotora y el uso óptimo de codón cuando los elementos plásmidos se derivan de una especie diferente.
Los estudios de pérdida de funciones son uno de los enfoques generales para investigar las posibles funciones de los genes de interés. Con el fin de estudiar la función génica durante la regeneración, un knock-out debe realizarse idealmente justo antes de una lesión para evitar efectos en el desarrollo. Además, el knock-out debe limitarse tanto a los NSC como a la región de regeneración. Un nocaut del gen objetivo en todos los SCN (incluidos los del cerebro, que es el caso en los sistemas Cre-LoxP), puede producir efectos no relacionados con la regeneración que pueden confundir la interpretación de los resultados. Afortunadamente, la estructura de la médula espinal axolotl proporciona una oportunidad única para el desaqueo con tiempo y espacio restringido en los NSC. La mayoría de los NSC de la médula espinal están en contacto con el canal central y constituyen la gran mayoría de las células en contacto con el canal central16,17. Por lo tanto, una inyección del complejo CAS9-gRNA en el canal central, seguida de electroporación, permite la administración a los NSC de la médula espinal en una región deseada en un momento específico4,18,19. Este protocolo demuestra cómo se lleva a cabo esto, lo que conduce a un nocaut altamente penetrante en los NSC de la médula espinal objetivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito permite el desoparamiento de genes restringidos en el tiempo y el espacio en los SCN en la médula espinal del axolotl. El protocolo actual permite la segmentación específica de los SCN en un momento y una ubicación definidos con alta penetrancia. Evita posibles efectos no deseados que se originan en el knock-out de genes en los SCN en otras regiones como el cerebro que se producen cuando se utiliza el sistema Cre-LoxP. También evita los efectos del desarrollo que se originan en un knock-out per…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Profesora Elly M. Tanaka por su apoyo continuo y a largo plazo. Este trabajo fue apoyado por una Beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) (317716), Becas de Inicio de Investigación de la Universidad Normal del Sur de China (S82111 y 8S0109), y una Beca de la Fundación de Ciencia postdoctoral de China (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referências
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