الجينات المباشرة ضرب من Axolotl الحبل الشوكي الخلايا الجذعية العصبية عن طريق الكهربائي من المجمعات CAS9 البروتين-gRNA
Summary
يقدم هنا بروتوكول لتنفيذ الوقت والفضاء مقيدة الجينات ضرب الخروج في الحبال الشوكي ة عن طريق حقن مجمع CAS9-gRNA في القناة المركزية الحبل الشوكي تليها الكهربائي.
Abstract
الساكسوتول لديه القدرة الفريدة على تجديد الحبل الشوكي بالكامل. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الخلايا الاستئصالية المتبقية كخلايا جذعية عصبية (NSCs) طوال الحياة، والتي تنتشر لإصلاح الأنبوب الاستئصالي والتفريق في الخلايا العصبية المفقودة بعد إصابة الحبل الشوكي. يمكن أن يؤدي فك رموز كيفية احتفاظ هذه الشركات الوطنية للضمان ة بتعدد القوى بعد التنمية والتكاثر عند إصابة الحبل الشوكي لإصلاح الهيكل الدقيق لما قبل الإصابة، إلى توفير رؤية قيمة حول كيفية تجديد الحبال الشوكية للثدييات وكذلك خيارات العلاج المحتملة. ومن خلال إجراء عمليات خروج الجين في مجموعات فرعية محددة من الشركات غير الحكومية في غضون فترة زمنية محدودة، سيسمح بدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات التجديدية، دون أن تُحيرها آثار اضطراب التنمية. يوصف هنا هو وسيلة لأداء الجينات خروج المغلوب في NSCs الحبل الشوكي axolotl باستخدام نظام CRISPR-Cas9. عن طريق حقن مجمع CAS9-gRNA في القناة المركزية للحبل الشوكي تليها الكهربائي، يتم ضرب الجينات المستهدفة في NSCs داخل مناطق محددة من الحبل الشوكي في نقطة زمنية مرغوب فيها، مما يسمح للدراسات الجزيئية من NSCs الحبل الشوكي خلال التجديد.
Introduction
الحبل الشوكي لمعظم الفقاريات غير قادر على التجدد بعد الإصابة، مما يؤدي إلى إعاقة دائمة. العديد من السلاماندرز، مثل axolotl، هي استثناءات ملحوظة. يمكن للaxolotl تجديد كامل الحبل الشوكي متطابقة هيكليا واستعادة تماما وظيفة الحبل الشوكي. الكثير من القدرة التجديدية للحبل الشوكي axolotl يرجع إلى الخلايا ependymal. هذه الخلايا خط القناة المركزية، وعلى عكس تلك الموجودة في الثدييات، والخلايا الأيبنديمال axolotl لا تزال الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) التنمية ما بعد الجنين. بعد إصابة الحبل الشوكي (على سبيل المثال، من بتر الذيل)، تنتشر هذه NSCs لإعادة زراعة الأنبوب ependymal والتفريق لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة1،2،3. الكشف عن كيفية النفثالينات الحبل الشوكي axolotl لا تزال متعددة القوى وتصبح نشطة بعد الإصابة يمكن أن توفر معلومات قيمة عن وضع استراتيجيات علاجية جديدة للمرضى البشر.
بسبب التقدم المحرز في تقنية الخروج من الخروج الجينات CRISPR-Cas9، أصبح أداء خروج المغلوب لفك وظيفة الجينات أسهل، وقد ثبت أن لها إمكانية تطبيق واسعة في مختلف الأنواع، بما في ذلك axolotls4،5، 6 , 7 , 8. الإصدارات الأخيرة من الجينوم الأكسولوت الكامل والنسخ يسمح الآن أي موضع الجينوم أنتكون مستهدفة ولتقييم أفضل للآثار خارج الهدف 9،10،11،12 , 13 , 14.وقد وضعت بروتوكولات الأمثل لضرب والخروج في axolotls باستخدام نظام CRISPR-Cas915. وقد ثبت تسليم الآلات كريسبر-Cas9 في شكل CAS9 البروتين-gRNA ريبونوكليوبروتين (RNP) أن تكون أكثر كفاءة من استخدام Cas9 وgRNA ترميز بلازميدات4. ومن المرجح أن يرجع ذلك إلى أن RNP أصغر في الحجم من ناقلات البلازميد، وقدرته على إنشاء فواصل الحمض النووي على الفور، وحماية الحمض النووي الريبي من تدهور الحمض النووي الريبي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الـ RNPs يتجاوز النسخ والترجمة؛ وبالتالي، فإنه يتجنب قضايا مثل قوة المروج والاستخدام الأمثل codon عندما تستمد عناصر بلازميد من نوع مختلف.
دراسات فقدان الوظيفة هي واحدة من النهج العامة للتحقيق في الوظائف المحتملة للجينات ذات الأهمية. من أجل دراسة وظيفة الجينات أثناء التجديد، ينبغي أن يتم تنفيذ خروج المغلوب بشكل مثالي قبل الإصابة مباشرة لتجنب الآثار على التنمية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يقتصر الخروج على كل من المراكز الوطنية للتحقق ومنطقة التجديد. قد يؤدي خروج الجين المستهدف في جميع النفثالينات غير صحيح (بما في ذلك تلك الموجودة في الدماغ، وهو الحال في أنظمة Cre-LoxP)، إلى آثار لا علاقة لها بالتجدد التي يمكن أن تشوش تفسير النتائج. لحسن الحظ، يوفر هيكل الحبل الشوكي axolotl فرصة فريدة من نوعها للخروج من الخروج مقيدة بالوقت والفضاء في NSCs. معظم الـ NSCs الحبل الشوكي على اتصال مع القناة المركزية وتشكل الغالبية العظمى من الخلايا في اتصال مع القناة المركزية16،17. لذلك، حقن مجمع CAS9-gRNA في القناة المركزية، تليها الكهربائي، يسمح بالتسليم إلى NSCs الحبل الشوكيفي المنطقة المطلوبة في وقت محدد 4،18،19. ويبين هذا البروتوكول كيفية تنفيذ ذلك، مما يؤدي إلى اختراق شديد في المراكز الوطنية للنشح في الحبل الشوكي المستهدف، ثم يجري تحليل لاحق لدراسة الآثار على التجدد وسلوك مجلس الأمن القومي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول الموصوف بضيق الوقت والمكان في الجين المقيد في NSCs في الحبل الشوكي axolotl. يسمح البروتوكول الحالي باستهداف محدد للشبكات الوطنية القومية في وقت وموقع محددين مع وجود نسبة عالية. فإنه يتجنب الآثار غير المرغوب فيها المحتملة الناشئة عن الجينات خروج المغلوب في NSCs في مناطق أخرى مثل ا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأستاذة إيلي م. تاناكا على دعمها المستمر والطويل الأجل. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (NSFC) منحة (317716)، ومنح بدء البحوث من جامعة جنوب الصين العادية (S82111 و 8S0109)، ومنحة مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referências
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologia do Desenvolvimento. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
