Direkte gen knock-out af Axolotl rygmarv neurale stamceller via elektroporation af CAS9 protein-gRNA komplekser
Summary
Præsenteret her er en protokol til at udføre tid-og rum-begrænset gen knock-out i Axolotler rygmarvs ledninger ved at injicere CAS9-gRNA kompleks i rygmarven central kanalen efterfulgt af elektro poration.
Abstract
Axolotler har den unikke evne til at regenerere rygmarven fuldt ud. Dette skyldes i høj grad de ependymale celler forbliver som neurale stamceller (NSCs) gennem hele livet, som formere sig til at reformere ependymal røret og differentiere i tabte neuroner efter rygmarvsskade. Dechifrere hvordan disse NSCs bevarer pluristyrke efter udvikling og formere sig på rygmarvsskade at reformere den nøjagtige præ-skade struktur kan give værdifuld indsigt i, hvordan pattedyrs rygmarv kan regenerere samt potentielle behandlingsmuligheder. Udførelse af gen-Knock-outs i specifikke undergrupper af nscs inden for en begrænset tidsperiode vil gøre det muligt at studere de molekylære mekanismer bag disse regenerativ processer uden at blive forvirret af udviklingsmæssige forstyrrelser. Beskrevet her er en metode til at udføre gen knock-out i Axolotler rygmarven NSCs ved hjælp af CRISPR-Cas9 systemet. Ved at injicere CAS9-gRNA-komplekset ind i rygmarven central kanalen efterfulgt af elektroporation, er målgener slået ud i NSCs inden for specifikke områder af rygmarven på et ønsket tidspunkt, hvilket giver mulighed for molekylære undersøgelser af rygmarvs NSCs under Regenerering.
Introduction
Rygmarven fra de fleste hvirveldyr er ikke i stand til at regenerere efter skade, hvilket fører til permanent invaliditet. Flere salamanders, såsom Axolotl, er bemærkelsesværdige undtagelser. Axolotler kan helt regenerere en strukturelt identisk rygmarv og helt genoprette rygmarv funktion. Meget af den regenerativ evne af Axolotler rygmarven skyldes ependymale celler. Disse celler linje den centrale kanal, og i modsætning til dem i pattedyr, Axolotler ependymale celler forbliver som neurale stamceller (NSCs) post-embryonale udvikling. Efter rygmarvsskade (f. eks. fra en hale amputation), disse nscs formere sig at regrow ependymal røret og differentiere for at erstatte tabte neuroner1,2,3. Afdækning af, hvordan Axolotler rygmarven NSCs forbliver pluripotente og aktiveres efter skade kan give værdifulde oplysninger om udvikling af nye terapeutiske strategier for humane patienter.
På grund af fremskridt i crispr-Cas9-genet knock-out-teknikken er det blevet lettere at udføre Knock-outs for at dechifrere genfunktionen, og det har vist sig at have bred anvendelighed i forskellige arter, herunder kendt4,5, 6 , 7 , 8. den nylige frigivelse af det fulde Axolotler genom og transkriptomet gør det nu muligt at målrette en eventuel genomlocus og for bedre at kunne vurdere de off-Target effekter9,10,11,12 , 13 , 14. optimerede protokoller er udviklet til knock-out og Knock-in i kendt ved hjælp af crispr-Cas9 system15. Levering af crispr-Cas9 maskiner i form af Cas9 protein-grna ribonucleoprotein (RNP) har vist sig at være mere effektiv end at bruge Cas9 og grna-kodning plasmider4. Dette skyldes sandsynligvis, at RNP er mindre i størrelse end plasmid vektorer, dens evne til at skabe DNA bryder straks, og beskyttelse af gRNA fra RNA nedbrydning. Desuden ved hjælp af RNPs omgår transskription og oversættelse; således, det undgår spørgsmål som promotor styrke og optimal codon skik, når plasmid elementer er afledt af en anden art.
Tab af funktionsundersøgelser er en af de generelle tilgange til at undersøge potentielle funktioner af gener af interesse. For at studere gen funktion under regenerering, en knock-out bør ideelt set udføres lige før en skade for at undgå virkninger på udviklingen. Desuden bør knock-out være begrænset til både NSCs og region for regenerering. En knock-out af målgenet i alle NSCs (herunder dem i hjernen, som er tilfældet i CRE-LoxP-systemer), kan producere effekter ikke relateret til regenerering, der kan tolerere fortolkningen af resultater. Heldigvis giver strukturen af Axolotler rygmarven en unik mulighed for tid-og plads begrænset knock-out i NSCs. De fleste af rygmarven nscs er i kontakt med den centrale kanal og udgør langt størstedelen af cellerne i kontakt med den centrale kanal16,17. Derfor, en injektion af CAS9-grna kompleks i den centrale kanal, efterfulgt af elektro poration, giver mulighed for levering til rygmarvs nscs i en ønsket region på et bestemt tidspunkt4,18,19. Denne protokol viser, hvordan dette udføres, hvilket fører til stærkt penetrateret knock-out i de målrettede rygmarvs NSCs. efterfølgende analyse udføres derefter for at studere virkningerne på regenerering og NSC adfærd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokol giver tid og plads begrænset gen knock-out i NSCs i Axolotler rygmarven. Den nuværende protokol tillader specifik målretning af NSCs på et defineret tidspunkt og sted med høj penetrans. Det undgår potentielle uønskede virkninger fra gen knock-out i NSCs i andre regioner såsom hjernen, der opstår, når du bruger CRE-LoxP-systemet. Det undgår også udviklingsmæssige virkninger, der stammer fra en vedvarende knock-out, så studiet af genfunktion fokuseret på regenerering. Desuden kan denne…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Prof. Elly M. Tanaka for hendes vedvarende og langsigtede støtte. Dette arbejde blev støttet af en National Natural Science Foundation of China (NSFC) Grant (317716), forskning starter tilskud fra South China Normal University (S82111 og 8S0109), og en China postdoc Science Foundation Grant (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referências
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologia do Desenvolvimento. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
