Directe gen knock-out van Axolotl ruggenmerg neurale stamcellen via Elektroporation van CAS9 proteïne-gRNA complexen
Summary
Hier is een protocol voor het uitvoeren van tijd-en ruimtebeperkt gen knock-out in Axolotl ruggengraat koorden door het injecteren van CAS9-gRNA complex in het ruggenmerg centrale kanaal gevolgd door elektroporation.
Abstract
De axolotl heeft de unieke mogelijkheid om zijn ruggenmerg volledig te regenereren. Dit is grotendeels te wijten aan de Ependymale cellen overgebleven als neurale stamcellen (NSCs) gedurende het hele leven, die zich vermenigvuldigen om de Ependymale buis te hervormen en te differentiëren in verloren neuronen na ruggenmergletsel. Ontcijferen hoe deze NSCs de pluripotentie post-ontwikkeling behouden en zich vermenigvuldigen met ruggenmergletsel om de exacte voor schade structuur te hervormen, kan waardevol inzicht geven in hoe de ruggengraat van zoogdieren kan regenereren, evenals mogelijke behandelingsopties. Het uitvoeren van genknock-outs in specifieke subgroepen van NSCs binnen een beperkte tijdsperiode zal het mogelijk maken om de moleculaire mechanismen achter deze regeneratieve processen te bestuderen, zonder te worden verward door ontwikkelings verstoringen. Hier beschreven is een methode om genknock-out in Axolotl ruggenmerg NSCs uit te voeren met behulp van het CRISPR Cas9 systeem. Door het CAS9-gRNA-complex in het Ruggenmergkanaal te injecteren, gevolgd door elektroporation, worden doel genen in NSCs in specifieke gebieden van het ruggenmerg op een gewenst tijdstip uitgeschakeld, waardoor moleculaire studies van ruggenmerg NSCs tijdens Regeneratie.
Introduction
Het ruggenmerg van de meeste gewervelde dieren kan niet regenereren na letsel, wat leidt tot blijvende invaliditeit. Verschillende salamanders, zoals de axolotl, zijn opmerkelijke uitzonderingen. De axolotl kan een structureel identiek ruggenmerg volledig regenereren en de ruggenmerg functie volledig herstellen. Een groot deel van het regeneratieve vermogen van het ruggenmerg van Axolotl is te wijten aan Ependymale cellen. Deze cellen lijn het centrale kanaal, en in tegenstelling tot die in zoogdieren, Axolotl Ependymale cellen blijven als neurale stamcellen (NSCs) post-embryonale ontwikkeling. Na het ruggenmergletsel (bijv. van een staart amputatie), vermenigvuldigen deze nscs zich om de Ependymale buis te herkweken en te differentiëren om verloren neuronen1,2,3te vervangen. Het ondekken van hoe Axolotl-ruggenmerg NSCs pluripotente blijven en geactiveerd worden na letsel kan waardevolle informatie verschaffen over het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor menselijke patiënten.
Als gevolg van de vooruitgang in de crispr Cas9 genknock-out techniek, is het uitvoeren van knock-outs om de genfunctie te ontcijferen gemakkelijker geworden en is aangetoond dat het een brede toepasbaarheid heeft in verschillende soorten, waaronder Axolotls4,5, 6 , 7 , 8. de recente release van het volledige Axolotl genoom en transcriptome maakt het nu mogelijk elke genomische Locus te richten en voor een betere beoordeling van de doeleffecten 9,10,11,12 , 13 , 14. geoptimaliseerde protocollen zijn ontwikkeld voor knock-out en knock-in in Axolotls met behulp van het Crispr Cas9 systeem15. De levering van crispr Cas9 machines in de vorm van Cas9 proteïne-grna RiboNucleoProteïne (RNP) is efficiënter gebleken dan het gebruik van cas9 en grna-encoding plasmiden4. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de RNP kleiner is in grootte dan plasmide vectoren, haar vermogen om onmiddellijk DNA-onderbrekingen te maken en de gRNA te beschermen tegen RNA-degradatie. Bovendien, met behulp van RNPs omzeilt transcriptie en vertaling; Zo vermijdt het problemen zoals de kracht van de promotor en het optimale codon gebruik wanneer plasmide elementen zijn afgeleid van een andere soort.
Verlies-van-functie studies zijn een van de algemene benaderingen voor het onderzoeken van potentiële functies van genen van belang. Om de genfunctie tijdens de regeneratie te bestuderen, moet een knock-out idealiter net voor een blessure worden uitgevoerd om effecten op de ontwikkeling te voorkomen. Bovendien moet de knock-out worden beperkt tot zowel de NSCs en de regio van regeneratie. Een knock-out van het doel-gen in alle NSCs (met inbegrip van die in de hersenen, wat het geval is in CRE-LoxP-systemen), kan effecten veroorzaken die geen verband houden met regeneratie die de interpretatie van de resultaten kan vinden. Gelukkig biedt de structuur van de axolotl ruggenmerg een unieke kans voor tijd-en ruimtebeperkt knock-out in NSCs. Het merendeel van de ruggenmerg nscs zijn in contact met het centrale kanaal en vormen de overgrote meerderheid van de cellen in contact met het centrale kanaal16,17. Daarom kan een injectie van het CAS9-grna-complex in het centrale kanaal, gevolgd door elektroporation, de levering aan ruggenmerg nscs in een gewenste regio op een specifiek tijdstip4,18,19. Dit protocol laat zien hoe dit wordt uitgevoerd, wat leidt tot zeer penetrerende knock-out in de beoogde ruggenmerg NSCs. vervolgens wordt de analyse uitgevoerd om de effecten op regeneratie en NSC-gedrag te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het beschreven protocol maakt het mogelijk om in de NSCs in het ruggenmerg van Axolotl tijd en ruimte te beperken. Het huidige protocol maakt specifieke targeting van NSCs mogelijk op een bepaald tijdstip en locatie met hoge penetrantie. Het voorkomt potentiële ongewenste effecten die afkomstig zijn van genknock-out in NSCs in andere regio’s, zoals de hersenen die optreden bij het gebruik van het CRE-LoxP-systeem. Het voorkomt ook ontwikkelingseffecten die afkomstig zijn van een aanhoudende knock-out, waardoor de studie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Prof. Elly M. Tanaka voor haar voortdurende en lange termijn ondersteuning. Dit werk werd gesteund door een National Natural Science Foundation van China (NSFC) Grant (317716), onderzoek startsubsidies van de South China Normal University (S82111 en 8S0109), en een China postdoctorale Science Foundation Grant (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referências
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologia do Desenvolvimento. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
