Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Durchführung zeit- und raumbeschränkter Gen-Knock-out in Axolotl-Rückenmarksen vorgestellt, indem der CAS9-gRNA-Komplex in den Zentralkanal des Rückenmarks injiziert wird, gefolgt von Elektroporation.
Abstract
Das Axolotl hat die einzigartige Fähigkeit, sein Rückenmark vollständig zu regenerieren. Dies ist weitgehend auf die ependymalen Zellen zurückzuführen, die im Laufe des Lebens als neuronale Stammzellen (NSCs) verbleiben, die sich vermehren, um die ependymale Röhre zu reformieren und sich nach einer Rückenmarksverletzung in verlorene Neuronen zu differenzieren. Die Entschlüsselung, wie diese NSCs die Pluripotenz nach der Entwicklung beibehalten und sich bei Rückenmarksverletzungen vermehren, um die exakte Vorverletzungsstruktur zu reformieren, kann wertvolle Einblicke in die Art und Weise liefern, wie sich das Rückenmark von Säugetieren regenerieren kann, sowie mögliche Behandlungsmöglichkeiten. Die Durchführung von Gen-Knock-outs in bestimmten Teilmengen von NSCs innerhalb eines begrenzten Zeitraums wird es ermöglichen, die molekularen Mechanismen hinter diesen regenerativen Prozessen zu untersuchen, ohne durch entwicklungsstörende Effekte verwirrt zu werden. Hier wird eine Methode beschrieben, um Gen-Knock-out in Axolotl Rückenmarks-NSCs mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Durch die Injektion des CAS9-gRNA-Komplexes in den Zentralkanal des Rückenmarks, gefolgt von Elektroporation, werden Zielgene in NSCs innerhalb bestimmter Regionen des Rückenmarks zu einem gewünschten Zeitpunkt ausgeschlagen, was molekulare Studien von Rückenmarks-NSCs während erneuerung.
Introduction
Das Rückenmark der meisten Wirbeltiere kann sich nach verletzungen nicht regenerieren, was zu einer bleibenden Behinderung führt. Mehrere Salamander, wie das Axolotl, sind bemerkenswerte Ausnahmen. Das Axolotl kann ein strukturell identisches Rückenmark vollständig regenerieren und die Funktion des Rückenmarks vollständig wiederherstellen. Ein Großteil der Regenerationsfähigkeit des Axolotl Rückenmarks ist auf ependymale Zellen zurückzuführen. Diese Zellen säumen den zentralen Kanal, und im Gegensatz zu denen bei Säugetieren bleiben Axolotl-Ependymale Zellen als neuronale Stammzellen (NSCs) nach der embryonalen Entwicklung erhalten. Nach einer Rückenmarksverletzung (z.B. durch eine Schwanzamputation) vermehren sich diese NSCs, um die ependymale Röhre nachzuwachsen und sich zu unterscheiden, um verlorene Neuronen1,2,3zu ersetzen. Die Aufdeckung, wie Axolotl Rückenmarks-NSCs pluripotent bleiben und nach einer Verletzung aktiviert werden, kann wertvolle Informationen über die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für menschliche Patienten liefern.
Aufgrund der Fortschritte in der CRISPR-Cas9-Gen-Knock-out-Technik ist die Durchführung von Knock-outs zur Entschlüsselung der Genfunktion einfacher geworden und hat sich bei verschiedenen Arten, einschließlich Axolotls4,5, 6 , 7 , 8. Die kürzliche Veröffentlichung des vollständigen Axolotl-Genoms und Transkriptoms ermöglicht es nun, jeden genomischen Ort gezielt zu betrachten und die Off-Target-Effekte9,10,11,12 besser zu bewerten. , 13 , 14. Optimierte Protokolle wurden für Knock-out und Knock-in in Axolotls mit dem CRISPR-Cas9 System15entwickelt. Die Lieferung der CRISPR-Cas9-Maschinerie in Form von CAS9-Protein-gRNA-Ribonucleoprotein (RNP) hat sich als effizienter erwiesen als die Verwendung von Cas9- und gRNA-kodierenden Plasmiden4. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die RNP kleiner ist als Plasmidvektoren, ihre Fähigkeit, DNA-Brüche sofort zu erstellen, und der Schutz der gRNA vor DEM RNA-Abbau. Darüber hinaus wird die Transkription und Übersetzung durch RNPs umgangen; Somit vermeidet es Probleme wie Diebesstärke und optimale Codon-Nutzung, wenn Plasmidelemente von einer anderen Spezies abgeleitet werden.
Funktionsverluststudien sind eine der allgemeinen Ansätze zur Untersuchung potenzieller Funktionen von Genen von Interesse. Um die Genfunktion während der Regeneration zu untersuchen, sollte idealerweise ein Knock-out kurz vor einer Verletzung durchgeführt werden, um Auswirkungen auf die Entwicklung zu vermeiden. Darüber hinaus sollte der Knock-out sowohl auf die NSCs als auch auf die Region der Regeneration beschränkt werden. Ein Knock-out des Zielgens in allen NSCs (einschließlich der im Gehirn, was bei Cre-LoxP-Systemen der Fall ist), kann Effekte erzeugen, die nicht mit der Regeneration zusammenhängen und die Interpretation der Ergebnisse verwirren können. Glücklicherweise bietet die Struktur des Axolotl Rückenmarks eine einzigartige Möglichkeit für zeit- und raumbeschränkte Knock-out in NSCs. Die meisten Spinalmark NSCs sind in Kontakt mit dem zentralen Kanal und bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in Kontakt mit dem zentralen Kanal16,17. Daher ermöglicht eine Injektion des CAS9-gRNA-Komplexes in den zentralen Kanal, gefolgt von Elektroporation, die Lieferung an Rückenmarks-NSCs in einem gewünschten Bereich zu einem bestimmten Zeitpunkt4,18,19. Dieses Protokoll zeigt, wie dies geschieht, was zu einem stark durchdringenden Knock-out in den zielgerichteten Rückenmarks-NSCs führt. Anschließend werden anschließend Analysen durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Regeneration und das NSC-Verhalten zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll ermöglicht zeit- und raumbeschränkte Gen-Knock-out in den NSCs im Axolotl-Rückenmark. Das aktuelle Protokoll ermöglicht eine spezifische Ausrichtung von NSCs zu einem definierten Zeitpunkt und Ort mit hoher Penetranz. Es vermeidet mögliche unerwünschte Effekte, die durch Gen-Knock-out in NSCs in anderen Regionen wie dem Gehirn entstehen, die bei der Verwendung des Cre-LoxP-Systems auftreten. Es vermeidet auch Entwicklungseffekte, die von einem anhaltenden Knock-out ausgehen, so dass die U…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Prof. Elly M. Tanaka für ihre kontinuierliche und langfristige Unterstützung. Diese Arbeit wurde von einem Stipendium der National Natural Science Foundation of China (NSFC) (317716), Research Starting Grants der South China Normal University (S82111 und 8S0109) und einem China Postdoctoral Science Foundation Grant (2018M633067) unterstützt.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Referências
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologia do Desenvolvimento. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
