मौरीन स्मॉल इन्टेने्टर में इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट्स का इंट्रावाइटल इमेजिंग
Summary
हम वर्धक-लेबलित आईईएल को उलटे कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मौरीन छोटी आंत के इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करके जीएफपी-लेबल वाली आईईएल की कल्पना करने की विधि का वर्णन करते हैं। इस तकनीक अप करने के लिए श्लेष्म के भीतर जीवित कोशिकाओं की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है 4 ज और आंतों प्रतिरक्षा-उपकला बातचीत की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
आंतों के उपकला की प्रतिरक्षा निगरानी में इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट्स व्यक्त करने वाले टी सेल रिसेप्टर (जेड आईईएल) की प्रतिरक्षा निगरानी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। $ टी सेल रिसेप्टर के लिए एक निश्चित लिगन्ड की कमी के कारण, $ आईईएल सक्रियण के विनियमन की हमारी समझ और विवो में उनके कार्य सीमित रहता है। यह संकेत नरेषद ोंकाको विनियमित करने में शामिल संकेतन मार्गों से पूछताछ करने के लिए वैकल्पिक रणनीतियों के विकास और स्थानीय सूक्ष्म पर्यावरण के लिए इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है। यद्यपि रोगजनक स्थानांतरण को सीमित करने के लिए व्यापक रूप से समझ में आ जाता है, अंतःशिरात इमेजिंग का उपयोग स्थिर-स्थिति में और आक्रामक रोगजनकों के जवाब में आईईएल/एपिथेलियल बातचीत की स् पैटियोटेम्पोरल गतिशीलता को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। इसमें, हम एक GFP के छोटे आंत्र mucosa में आईईएल प्रवासी व्यवहार visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत – टी सेल रिपोर्टर माउस उल्टे कताई डिस्क confocal लेजर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर. हालांकि इस दृष्टिकोण की अधिकतम इमेजिंग गहराई दो-फोटोन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के उपयोग के सापेक्ष सीमित है, कताई डिस्क confocal लेजर माइक्रोस्कोपी कम photobleaching के साथ उच्च गति छवि अधिग्रहण का लाभ प्रदान करता है और फोटो नुकसान. 4D छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, टी सेल निगरानी व्यवहार और पड़ोसी कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद विश्लेषण किया जा सकता है आईईएल सक्रियण और आंतों mucosa के भीतर समारोह में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.
Introduction
इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट्स (आईईएल) आंतों के उपकला के भीतर स्थित होते हैं, और दोनों तहखाने झिल्ली के साथ और पार्श्व अंतरकोशिकीय अंतरिक्ष1में आसन्न उपकला कोशिकाओं के बीच पाए जाते हैं। हर 5-10 उपकला कोशिकाओं के लिए लगभग एक आईईएल है; ये आईईएल आंत्र उपकला बाधा2के बडे विस्तार की प्रतिरक्षा निगरानी प्रदान करने के लिए प्रहरी के रूप में कार्य करते हैं . आईईएल जो कि जेड टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) को व्यक्त करता है, में यूरीन छोटी आंत में कुल आईईएल जनसंख्या का 60% तक शामिल होता है। [ टी-सेल की कमी वाले चूहों में अध्ययन आंतों की चोट, सूजन और संक्रमण3,4,5के जवाब में इन कोशिकाओं की काफी सुरक्षात्मक भूमिका प्रदर्शित करते हैं । Tcrd नॉकआउट माउस6के उत्पादन के बावजूद , IEL जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ इस तथ्य के भाग में सीमित है कि ligands द्वारा मान्यता प्राप्त अभी तक7की पहचान की जानी है . नतीजतन, इस सेल आबादी का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की कमी ने शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत टीसीआर सक्रियण और कार्य की भूमिका की जांच करना मुश्किल बना दिया है। इस अंतर को भरने के लिए, हमने विवो में बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करने के साधन के रूप में आईईएल प्रवासी व्यवहार और पड़ोसी आंत्रकोशिकाओं के साथ बातचीत को विज़ुअलाइज़ करने के लिए लाइव इमेजिंग तकनीक विकसित की है।
पिछले दशक में, intravital इमेजिंग काफी आंतों जीव विज्ञान के कई पहलुओं में शामिल आणविक घटनाओं की हमारी समझ का विस्तार किया गया है, उपकला सेल बहा8सहित, उपकला बाधा समारोह 9 के विनियमन ,10, luminal सामग्री के माइलॉयड सेल नमूना11,12, और मेजबान microbe बातचीत11,13,14,15,16 . आईईएल जीव विज्ञान के संदर्भ में, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के उपयोग ने आईईएल गतिशीलता की spatiotemporal गतिशीलता और उनके निगरानी व्यवहार को मध्यस्थता करने वाले कारकों पर प्रकाश डालाहै 13,14,15, 16. TcrdH2BeGFP के विकास (TcrdEGFP) रिपोर्टर चूहों, जो परमाणु GFP अभिव्यक्ति17द्वारा IELs लेबल , पता चला है कि – आईएलएस उपकला के भीतर अत्यधिक गतिशील हैं और एक अद्वितीय निगरानी व्यवहार है कि माइक्रोबियल के लिए उत्तरदायी है प्रदर्शन संक्रमण17,13,14. हाल ही में, एक और जेड टी सेल रिपोर्टर माउस विकसित किया गया था (Tcrd-GDL) जो कोशिका द्रव्य में GFP व्यक्त करने के लिए पूरे सेल18के दृश्य की अनुमति है. इसी प्रकार की पद्धति का उपयोग विशिष्ट कीमोकीन रिसेप्टर्स की आवश्यकता की जांच करने के लिए किया गया है, जैसे जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर)-18 और -55, आईईएल गतिशीलता की गतिशीलता पर19,20. एक सेल-विशिष्ट संवाददाता की अनुपस्थिति में, सीडी 8 के विरुद्ध फ्लोरोसेंट संयुग्मी एंटीबॉडी का उपयोग विवो19,20में आईईएल गतिशीलता की कल्पना और ट्रैक करने के लिए किया गया था। हालांकि दो फोटोलेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी आमतौर पर intravital इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, कताई डिस्क confocal लेजर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कम से कम पृष्ठभूमि शोर के साथ उच्च गति और उच्च संकल्प मल्टी चैनल छवियों पर कब्जा करने के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है. यह प्रौद्योगिकी आंतों के श्लेष्म के जटिल सूक्ष्म पर्यावरण के भीतर प्रतिरक्षा/उपथीली बातचीत की spatiotemporal गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए आदर्श है। इसके अलावा, विभिन्न ट्रांसजेनिक और/
Protocol
Representative Results
Discussion
अंत:प्रज्ञा माइक्रोस्कोपी तकनीकों के विकास ने उपकोशिकीय संरचनाओं के पुनर्गठन का निरीक्षण करने का एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान किया है8,9,22, सेल-सेल बातचीत12, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH R21 AI143892, न्यू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन अनुदान, Busch जैव चिकित्सा अनुदान (KLE) द्वारा समर्थित है. हम पांडुलिपि संपादन और प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया डेटा प्रदान करने में उसकी सहायता के लिए Madeleine हू धन्यवाद.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
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