Dannelsen af humane Periodontal ligament Cell Sfæroider på chitosan Films
Summary
Her præsenterer vi protokoller for dyrkning af humane Periodontal ligament (PDL) celle sfæroider af chitosan film. Kulturen i tredimensionale (3D) cellulære sfæroider giver et alternativ til konventionel vævskultur polystyren (TCPS) kultur system.
Abstract
Periodontal ligament (PDL) celler holder stort løfte for Periodontal vævsregenerering. Konventionelt, PDL celler er kultiveret på to-dimensionelle (2D) substrater som vævskultur polystyren (TCPS). Der er imidlertid observeret karakteristiske ændringer af PDL-celler under in vitro-kulturen. Dette fænomen er sandsynligvis fordi 2D TCPS adskiller sig fra in vivo tredimensionale (3D) mikromiljø. Sammenlignet med celler, der er dyrket på 2D-substrater, udviser celler, der dyrkes i et 3D-mikromiljø, flere ligheder med in vivo-celler. Derfor, 3D cellekultur modeller giver et lovende alternativ til konventionelle 2D enkeltlags cellekultur. For at forbedre konventionelle PDL cellekultur modeller, har vi for nylig udviklet en 3D cellekultur metode, som er baseret på sfæroide dannelse af PDL celler på chitosan film. Her præsenterer vi detaljerede celle sfæide kultur protokoller baseret på chitosan film. 3D kultur system af PDL cellulære sfæroider overvinde nogle af begrænsningerne i forbindelse med konventionelle 2D enkeltlags cellekultur, og dermed kan være egnet til at producere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidige Periodontal vævsregeneration.
Introduction
Periodontitis, initialiseret primært af dental plaque1, er karakteriseret ved skaden af Periodontal væv, herunder Periodontal ligament (PDL), alveolær knogle, og cementum. Nuværende behandlinger for parodontitis er normalt vellykket i at forhindre udviklingen af den aktive sygdom, men regenerering af tabte Periodontal væv er fortsat en klinisk udfordring. For nylig er der gjort vigtige fremskridt i cellebaserede tilgange til Periodontal vævsregenerering for at overvinde ulemperne ved nuværende behandlinger2,3,4.
Vores tidligere systematiske gennemgang afslørede, at PDL celler viste stort potentiale for Periodontal regenerering5. Konventionelt, PDL celler er kultiveret på to-dimensionelle (2D) substrater som vævskultur polystyren (TCPS). Der er imidlertid observeret karakteristiske ændringer af PDL-celler under in vitro-kultur6. Dette fænomen er sandsynligvis fordi 2D TCPS adskiller sig fra in vivo tredimensionale (3D) mikromiljø7. Sammenlignet med celler, der er dyrket på 2D-substrater, udviser celler, der dyrkes i et 3D-mikromiljø, flere ligheder med in vivo-cellerne8. Derfor, 3D cellekultur modeller giver et lovende alternativ til konventionelle 2D enkeltlags cellekultur.
Konventionel 3D-kultur metode er indkapstende celler i 3D biomaterialer. Sammenlignet med celler indkapslet i 3D-biomaterialer, efterligner cellulære sfæroider in vivo-situationen nøjere, fordi sfæroider er aggregater af celler, der vokser fri for fremmede materialer9,10,11, 12. det rapporteres, at cellulære sfæroider PROMOVEREDE MSC-bioaktiviteter via bevaring af komponenter af ekstracellulær matrix (ECM), herunder fibronectin og Laminin13. For at forbedre konventionelle PDL cellekultur modeller, har vi for nylig udviklet en 3D PDL cellekultur metode, som er baseret på sfæroide dannelse af PDL celler på chitosan film14. Spheroid-dannelsen øgede den selvfornyende og osteogene differentierings kapacitet for PDL-celler14. Her præsenterer vi detaljerede PDL celle sfæide kultur protokoller baseret på chitosan film. 3D kultur system af PDL cellulære sfæroider overvinde nogle af de mangler i forbindelse med konventionelle TCPS cellekultur, og dermed kan være egnet til at producere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidige Periodontal vævsregeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nærværende undersøgelse indførte en 3D cellekultursystem til at overvinde nogle begrænsninger i forbindelse med konventionelle 2D enkeltlags cellekultur. Ifølge protokollen blev PDL cellulære sfæroider med succes dannet ved dyrkning af celler på chitosan film. Vores tidligere undersøgelse rapporterede, at sfæoide dannelsen øgede selv fornyelsen og osteogen differentiering kapaciteter af PDL celler14. I stedet for at bruge et enzym til at høste celler fra TCPS, kunne PDL celle sfæroid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev sponsoreret af National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 81700978), grundlæggende forskningsfonde for de centrale universiteter (1504219050), Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1432800), og Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
Referências
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Pesquisa do Câncer. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
