היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של culturing ברצועה חניכיים האדם (PDL) תא spheroids על ידי סרטים chitosan. תרבות של הספרואידים תלת ממדיים (3D) הסלולר מספק אלטרנטיבה של מערכת התרבות הקונבנציונלית פוליסטירן מרקמת רקמה (TCPS).
Abstract
ברצועה חניכיים (PDL) תאים להחזיק הבטחה גדולה להתחדשות רקמת חניכיים. באופן מקובל, תאים PDL הם מתורבתים על דו מימדי (2D) מצעים כגון פוליסטירן מעור הרקמה (TCPS). עם זאת, שינויים אופייניים של תאים PDL נצפו במהלך תרבות מבחנה. תופעה זו היא כנראה משום שהדו הדו שונה ממיקרו-vivo תלת-מימדי (3D). בהשוואה לתאים בעלי מצעים דו-ממדיים, תאים שגדלו בתצוגה מיקרוסביבתית תלת-ממדית דומים יותר לתאים vivo. לכן, מודלים של תרבית תאים תלת-ממדיים מספקים חלופה מבטיחה לתרבות התאים הקונבנציונלית של 2D מונאולייר. כדי לשפר את המסורת המקובלת של התרבות התאית, פיתחנו לאחרונה שיטת התרבות התא 3D, אשר מבוססת על היווצרות ספרואיד של תאים PDL על סרטים chitosan. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של התרבות התאית המבוססת על סרטים chitosan. מערכת התרבות התלת-ממדית של PDL תאית הסלולר להתגבר על חלק מן המגבלות הקשורות תרבות התאים 2D קונבנציונאלי מונאולייר, ובכך עשוי להיות מתאים להפקת תאים PDL עם יעילות טיפולית משופרת עבור התחדשות רקמות העתיד חניכיים.
Introduction
חניכיים, מאותחל בעיקר על ידי רובד דנטלי1, מאופיין בנזק של רקמות חניכיים כולל ברצועה חניכיים (PDL), מכתשיים העצם, ו המלט. הטיפולים הנוכחיים עבור חניכיים מצליחים בדרך כלל במניעת ההתקדמות של המחלה הפעילה, אבל התחדשות של רקמות חניכיים איבד נשאר אתגר קליני. לאחרונה, התקדמות חשובה נעשתה בגישות מבוססות תא עבור התחדשות רקמות חניכיים כדי להתגבר על החסרונות של הטיפולים הנוכחיים2,3,4.
סקירה שיטתית הקודם שלנו חשף כי תאים PDL הראה פוטנציאל גדול התחדשות חניכיים5. באופן מקובל, תאים PDL הם מתורבתים על דו מימדי (2D) מצעים כגון פוליסטירן מעור הרקמה (TCPS). עם זאת, שינויים אופייניים של תאים PDL נצפו במהלך תרבות מבחנה6. תופעה זו היא ככל הנראה משום TCPS 2D שונה מן תלת מימדי (3D) מיקרוסביבה7. בהשוואה לתאים המתורבתות ב-2D מצעים, תאים הגדלים בתצוגה מיקרוסביבה 3D דומה יותר לתאים vivo8. לכן, מודלים של תרבית תאים תלת-ממדיים מספקים חלופה מבטיחה לתרבות התאים הקונבנציונלית של 2D מונאולייר.
שיטת התרבות התלת-ממדית המקובלת היא encapsulating תאים באמצעות ביואריאלס תלת-ממדיים. לעומת תאים שעברו אנקפסולציה ב ביואריאלס 3d, spheroids הסלולר לחקות את המצב vivo באופן הדוק יותר מכיוון spheroids הם אגרגטים של תאים הגדלים ללא חומרים זרים9,10,11, 12. מדווחים כי מכשירי הסלולר הסלולריים קידמו את הפעילות הביויוטית באמצעות שימור הרכיבים המתכלים (ecm), כולל פינבאקטין ולמינציה ב-13. כדי לשפר את המסורת המקובלת של התרבות התאית, פיתחנו לאחרונה שיטת התרבות של תא PDL 3D, אשר מבוססת על היווצרות ספרואיד של תאים PDL על chitosan סרטים14. היווצרות ספרואיד הגדילה את התחדשות עצמית ויכולות הבידול אוסטגניים של תאים PDL14. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של התרבות PDL מפורט ספרואיד מבוסס על סרטים chitosan. מערכת התרבות התלת-ממדית של PDL תאית הסלולר להתגבר על כמה חסרונות הקשורים בתרבות התא TCPS ובכך עשוי להיות מתאים להפקת תאים PDL עם יעילות טיפולית משופרת להתחדשות רקמת חניכיים עתידיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי הציג מערכת התרבות תא תלת-ממד כדי להתגבר על מספר מגבלות הקשורות לתרבות התא 2D קונבנציונאלי מונאולייר. על פי הפרוטוקול, מזהי הסלולר PDL נוצרו בהצלחה על ידי תאי culturing על סרטים chitosan. המחקר הקודם שלנו דיווח כי היווצרות ספרואיד הגדילה את התחדשות עצמית ויכולות הבידול אוסטגניים של תאים P…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה בחסות הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (NSFC 81700978), קרנות המחקר היסודי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (1504219050), הקרן המדע הטבעי של שנגחאי (17ZR1432800), ושנגחאי פרויקט חיפושי רפואי ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
Referências
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Pesquisa do Câncer. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
