Formación de esferoides de células de ligamento periodontal humano en Chitosan Films
Summary
Aquí, presentamos protocolos de cultivo de esferoides celulares del ligamento periodontal humano (PDL) por películas de quitosano. El cultivo de esferoides celulares tridimensionales (3D) proporciona una alternativa al sistema de cultivo de poliestireno (TCPS) de cultivo tisular convencional.
Abstract
Las células del ligamento periodontal (PDL) son muy prometedoras para la regeneración del tejido periodontal. Convencionalmente, las células PDL se cultivan en sustratos bidimensionales (2D), como el poliestireno de cultivo tisular (TCPS). Sin embargo, se han observado cambios característicos de las células PDL durante el cultivo in vitro. Este fenómeno se debe probablemente a que el TCPS 2D difiere del microambiente tridimensional in vivo (3D). En comparación con las células cultivadas en sustratos 2D, las células cultivadas en un microambiente 3D presentan más similitudes con las células in vivo. Por lo tanto, los modelos de cultivo de celdas 3D proporcionan una alternativa prometedora para el cultivo de células monocapa 2D convencional. Para mejorar los modelos convencionales de cultivo celular PDL, recientemente hemos desarrollado un método de cultivo celular 3D, que se basa en la formación de esferoides de células PDL en películas de quitosana. Aquí, presentamos protocolos detallados de cultivo de esferoides celulares basados en películas de quitosano. El sistema de cultivo 3D de esferoides celulares PDL supera algunas de las limitaciones relacionadas con el cultivo celular monocapa 2D convencional, y por lo tanto puede ser adecuado para la producción de células PDL con una eficacia terapéutica mejorada para la regeneración futura del tejido periodontal.
Introduction
La periodontitis, inicializada principalmente por placa dental1, se caracteriza por el daño de los tejidos periodontales incluyendo el ligamento periodontal (PDL), hueso alveolar, y cemento. Los tratamientos actuales para la periodontitis suelen tener éxito en la prevención del progreso de la enfermedad activa, pero la regeneración de los tejidos periodontales perdidos sigue siendo un desafío clínico. Recientemente, se han realizado importantes progresos en los enfoques basados en células para la regeneración del tejido periodontal para superar los inconvenientes de los tratamientos actuales2,3,4.
Nuestra revisión sistemática anterior reveló que las células PDL mostraron un gran potencial para la regeneración periodontal5. Convencionalmente, las células PDL se cultivan en sustratos bidimensionales (2D), como el poliestireno de cultivo tisular (TCPS). Sin embargo, se han observado cambios característicos de las células PDL durante el cultivo in vitro6. Este fenómeno se debe probablemente a que el TCPS 2D difiere del microambiente tridimensional in vivo (3D)7. En comparación con las células cultivadas en sustratos 2D, las células cultivadas en un microambiente 3D presentan más similitudes con las células in vivo8. Por lo tanto, los modelos de cultivo de celdas 3D proporcionan una alternativa prometedora para el cultivo de células monocapa 2D convencional.
El método de cultivo 3D convencional es encapsular células en biomateriales 3D. En comparación con las células encapsuladas en biomateriales 3D, los esferoides celulares imitan más de cerca la situación in vivo porque los esferoides son agregados de células que crecen libres de materiales extraños9,10,11, 12. Se informa que los esferoides celulares promovieron las bioactividades de MSC a través de la preservación de componentes de matriz extracelular (ECM), incluyendo fibronectina y laminina13. Para mejorar los modelos convencionales de cultivo celular PDL, recientemente hemos desarrollado un método de cultivo celular PDL 3D, que se basa en la formación de esferoides de células PDL en películas de quitosana14. La formación de esferoides aumentó la auto-renovación y las capacidades de diferenciación osteogénica de las células PDL14. Aquí, presentamos protocolos detallados de cultivo de esferoides de células PDL basados en películas de quitosano. El sistema de cultivo 3D de esferoides celulares PDL supera algunas de las deficiencias relacionadas con el cultivo celular TCPS convencional, y por lo tanto puede ser adecuado para la producción de células PDL con una eficacia terapéutica mejorada para la regeneración futura del tejido periodontal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente estudio introdujo un sistema de cultivo celular 3D para superar algunas limitaciones relacionadas con el cultivo celular monocapa 2D convencional. Según el protocolo, los esferoides celulares PDL se formaron con éxito mediante el cultivo de células en películas de quitosana. Nuestro estudio anterior informó que la formación de esferoides aumentó las capacidades de auto-renovación y diferenciación osteogénica de las células PDL14. En lugar de utilizar una enzima para cosechar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 81700978), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (1504219050), la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (17ZR1432800), y el Proyecto de Exploración Médica de Shanghái ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
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