Bildandet av mänskliga parodontala ligament cell Sfäroider på Chitosan Films
Summary
Här presenterar vi protokoll för odling av mänskliga periodontala ligament (PDL) cell sfäroider av Chitosan filmer. Kulturen av tredimensionell (3D) cellulära sfäroider ger ett alternativ till konventionella vävnad kultur polystyren (TCPS) kultur system.
Abstract
Parodontala ligament (PDL) celler hålla stort löfte för parodontala vävnad förnyelse. Konventionellt, PDL celler odlas på tvådimensionella (2D) substrat såsom vävnad kultur polystyren (TCPS). Emellertid har karakteristiska förändringar av PDL-celler observerats under in vitro-kulturen. Detta fenomen beror antagligen på att 2D TCPS skiljer sig från in vivo tredimensionell (3D) mikromiljö. Jämfört med celler odlade på 2D-substrat, celler som odlas i en 3D-mikromiljö uppvisar fler likheter med in vivo-celler. Därför, 3D cell kulturer modeller ger ett lovande alternativ för konventionell 2D enskiktslager cell kultur. För att förbättra konventionella PDL cell kultur modeller, har vi nyligen utvecklat en 3D-cell kultur metod, som bygger på sfäroid bildandet av PDL celler på Chitosan filmer. Här presenterar vi detaljerade cell sfäroid kultur protokoll baserade på Chitosan filmer. 3D-kulturen systemet av PDL cellulära sfäroider övervinna några av de begränsningar som rör konventionella 2D enskiktslager cell kultur, och därmed kan vara lämpliga för att producera PDL celler med en förbättrad terapeutisk effekt för framtida tandlossning vävnad förnyelse.
Introduction
Parodontit, initieras främst av dental plack1, kännetecknas av skador av parodontala vävnader inklusive parodontala ligament (PDL), alveolära ben, och cementum. Nuvarande behandlingar för parodontit är oftast framgångs rika i att förhindra utvecklingen av den aktiva sjukdomen, men regenerering av förlorade periodontala vävnader förblir en klinisk utmaning. Nyligen har viktiga framsteg gjorts i cellbaserade metoder för tandlossning vävnad förnyelse för att övervinna nack delarna med nuvarande behandlingar2,3,4.
Vår tidigare systematiska granskning visade att PDL-celler visade stor potential för parodontala förnyelse5. Konventionellt, PDL celler odlas på tvådimensionella (2D) substrat såsom vävnad kultur polystyren (TCPS). Emellertid har karakteristiska förändringar av PDL-celler observerats under in vitro-kultur6. Detta fenomen beror antagligen på att 2D TCPS skiljer sig från in vivo tredimensionell (3D) mikromiljö7. Jämfört med celler odlade på 2D-substrat, celler som odlas i en 3D-mikromiljö uppvisar fler likheter med in vivo-celler8. Därför, 3D cell kulturer modeller ger ett lovande alternativ för konventionell 2D enskiktslager cell kultur.
Konventionell 3D-kulturmetod är inkapsling celler i 3D biomaterial. Jämfört med celler inkapslade i 3D biomaterial, cellulära sfäroider efterlikna in vivo situationen närmare eftersom sfäroider är aggregat av celler som växer fritt från främmande material9,10,11, 12. det rapporteras att cellulära sfäroider främjas MSC bioverksamhet via bevarandet av extracellulär matrix (ECM) komponenter inklusive Fibronektin och laminin13. För att förbättra konventionella PDL cell kultur modeller, har vi nyligen utvecklat en 3D PDL cell kultur metod, som bygger på sfäroid bildandet av PDL celler på Chitosan filmer14. Sfäroid bildandet ökade själv förnyelse och osteogena differentiering kapacitet PDL-celler14. Här presenterar vi detaljerade PDL cell sfäroiden kultur protokoll baserade på Chitosan filmer. 3D-kulturen systemet av PDL cellulära sfäroider övervinna några av bristerna i samband med konventionella TCPS cell kultur, och därmed kan vara lämplig för att producera PDL celler med en förbättrad terapeutisk effekt för framtida tandlossning vävnad förnyelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här studien infördes en 3D cell kultur system för att övervinna vissa begränsningar i samband med konventionella 2D enskiktslager cell kultur. Enligt protokollet, PDL cellulära sfäroider framgångs rikt bildades genom odling av celler på Chitosan filmer. Vår tidigare studie rapporterade att sfäroid bildandet ökade själv förnyelse och osteogena differentiering kapacitet PDL celler14. Istället för att använda ett enzym för att skörda celler från TCPS, PDL cell sfäroider kun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie sponsrades av National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 81700978), grundläggande forsknings fonder för de centrala universiteten (1504219050), Natural Science Foundation i Shanghai (17ZR1432800), och Shanghai Medical prospektering Project ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
Referências
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Pesquisa do Câncer. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
