Ultralyd-utvidet primær voksen Fibroblast Isolation

Summary

Vi presenterer en protokoll for å isolere primær voksen fibroblaster på en enkel, rask og pålitelig måte, performable av nybegynnere (f. eks, studenter). Prosedyren kombinerer enzymatisk vev fordøyelse og mekanisk agitasjon med ultralydbølger for å få primær fibroblaster. Protokollen kan enkelt tilpasses spesifikke eksperimentelle krav (f.eks. menneskelig vev).

Abstract

Primær voksen fibroblaster har blitt et viktig verktøy for å studere fibrose, Fibroblast interaksjoner og betennelser i alle kroppens vev. Siden primære fibroblaster ikke kan dele på ubestemt tid på grunn av myofibroblast differensiering eller senescence induksjon, nye kulturer må etableres regelmessig. Det er imidlertid flere hindringer å overvinne under prosessene med å utvikle en pålitelig isolasjons protokoll og primær Fibroblast isolasjon seg selv: metoden vanskelighetsgrad (spesielt for nybegynnere), risikoen for bakteriell forurensning, nødvendig tid før primære fibroblaster kan brukes til eksperimenter, og påfølgende celle kvalitet og levedyktighet. I denne studien, en rask, pålitelig og lett å lære protokollen for å isolere og kultur primære voksen fibroblaster fra mus hjerte, lunge, lever og nyre kombinere enzymatisk fordøyelse og ultralyd omrøring er gitt.

Introduction

Fibroblaster er flate, spindel-formede celler med flere Stel prosesser og en omfattende grov endoplasmatiske retikulum^1,2. En gjennomsnittlig Fibroblast måler 30-100 μm og har en levetid på 57 ± 3 dager^1,3. Den gjennomsnittlige celle syklus varigheten av menneskelig fibroblaster varierer fra 16-48 h avhengig av kulturen forhold⁴. Det er dokumentert at replicative kapasitet og funksjonell kvalitet på kulturperler primære fibroblaster negativt samsvarer med donor alder, noe som tyder på at yngre donorer (dyr eller pasienter) bør foretrekkes hvis mulig^5,6 .

Fibroblaster utgjør en dominerende celle type mest pattedyr kroppens vev. Til tross for deres allestedsnærværende tilstedeværelse, den molekylære identifisering av fibroblaster er fortsatt en utfordring⁷. Fibroblaster migrere til å utvikle vev og organer fra ulike kilder under embryonale utviklingen⁸. Av denne grunn er det en overflod av markør proteiner som finnes i fibroblaster mens unike markør proteiner, som er til stede i hver Fibroblast befolkning og eksklusivt for fibroblaster, er fortsatt mangler. Uttrykks mønstre for flere gjenkjente markører brukes derfor vanligvis til å identifisere fibroblaster. Blant de mest anerkjente markører er vimentin, humant Fibroblast overflate protein (hFSP), discoidin domene reseptor 2 (DDR2) og Alpha glatt muskel utgangen (αSMA).

Fibroblaster er de viktigste ekstracellulære matrise (ECM)-produserende celle type. Derved, fibroblaster opprettholde en ryddig vev arkitektur og gi mekanisk støtte for nærliggende celler¹. Balansen mellom ECM-syntese og-degradering er en godt regulert prosess. Skifter mot syntese markere begynnelsen av overdreven ECM deponering som, hvis ikke avsluttet, fører til fibrose. Fibrose er formidlet av myofibroblasts, som stammer fra aktivert fibroblaster gjennomgår molekylær og phenotypical endringer. Et kjennetegn på myofibroblasts er forbedret sekresjon av ECM og cytokiner og uttrykk for ryddig arrangert αSMA microfilaments⁹.

Primære fibroblaster har vært i søkelyset av nyere forskning med fokus på fibrose, vevs betennelse og Fibroblast-kreft-celle interaksjoner^10,11. Men for å effektivt studere Fibroblast egenskaper i helse og sykdom, er det nødvendig å isolere levedyktig primær voksen fibroblaster på jevnlig basis. Det finnes flere metoder for å isolere fibroblaster^12,13,14. De tre store metoder for Fibroblast isolasjon er utvekst fra vev biter¹², enzymatisk vev fordøyelse¹⁵, og enzymatisk av hul organer^9,13,16. Fordelen med utvekst er en skånsom isolasjons prosess uten enzymatisk celle degradering. På den annen side, utvekst kulturer krever vanligvis forlenget kultur perioder inntil cellene kan brukes til eksperimenter. Vanlig enzymatisk fordøyelsen er rask, men bærer en risiko for forurensning med andre celletyper (f. eks, endothelial celler) eller bakterier i agitasjon prosessen, som er nødvendig for å mekanisk oppløse vevet. Videre disse metodene er ofte forseggjort og krever tid og dyktighet til å lære.

Når det gjelder viktigheten av primære fibroblaster i forskning, er det fortsatt behov for å optimalisere eksisterende celle isolasjon tilnærminger i form av hurtighet, enkelhet og pålitelighet. Her, en roman ultralyd-basert enzymatisk Fibroblast isolasjon metode levere høy kvalitet celler er gitt.

Protocol

Følgende protokoll følger de institusjonelle dyre omsorgen retningslinjer for Technische Universität Dresden, Tyskland (filnummer: T 2014/4) samt internasjonalt aksepterte dyre omsorg retningslinjer (FELASA)17. Figur 1 visualiserer celle isolasjons prosessen. 1. klargjøre oppsett, materiale og Media Forbered cellekultur medium, PBS løsning, kollagenase blanding lagerløsning (Rekonstituer 50 mg lyofilisert kollagenase blandin…

Representative Results

Evnen til denne protokollen til å isolere voksne fibroblaster fra solid murine vev ble demonstrert. Levedyktige fibroblaster ble innhentet som kan brukes til senere eksperimenter som immunofluorescence farging eller spredning eksperimenter (figur 2D-F, figur 5A). Voksen fibroblaster er flate spindel-formede celler med flere cellulære prosesser som vanligvis vokser i monolagere12</s…

Discussion

Sammenlignet med udødeliggjort Fibroblast cellelinjer, har primære fibroblaster flere fordeler. De kan isoleres kostnadseffektivt i høy kvalitet og kvantitet. Videre primære kulturer tilbyr muligheten til å studere celler fra flere individer, noe som øker påliteligheten av oppnådde resultater og reduserer sannsynligheten for bare å studere cellekultur gjenstander. Kontinuerlig generering av nye primære kulturer forhindrer genetiske forandringer som ofte oppstår etter gjentatt passaging^21</sup…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 ml
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577