אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ
Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).
Abstract
הראשי פיברותקיעות למבוגרים הפכו כלי חשוב ללמוד פיברוזיס, פיברוהפיצוץ אינטראקציות ודלקת בכל רקמות הגוף. כיוון שהפיברופיצוצים העיקריים אינם יכולים להפריד ללא הגבלת הזמן בשל בידול או הזדקנות ביולוגית, יש להקים תרבויות חדשות באופן סדיר. עם זאת, ישנם מספר מכשולים כדי להתגבר במהלך התהליכים של פיתוח פרוטוקול בידוד אמין ובידוד העיקרי פיברוהפיצוץ עצמו: דרגת הקושי של השיטה (במיוחד למתחילים), הסיכון לזיהום חיידקי, ה זמן נדרש עד הפיברותקיעות הראשונית ניתן להשתמש עבור ניסויים, ואת איכות התא הבאים הכדאיות. במחקר זה, פרוטוקול מהיר, אמין וקל ללמידה כדי לבודד ולהתרבות למבוגרים בלבד ותרבות מתוך לב העכבר, ריאות, כבד וכליות המשלב עיכול אנזימטי ועצבנות אולטרה סאונד מסופק.
Introduction
פיברותקיעות הם שטוחים, תאים בצורת ציר עם תהליכים stellate מרובים ומעין הרשתית הרחב מחוספס רשתית פלזמית1,2. ממוצע פיברוהפיצוץ אמצעים 30-100 יקרומטר ויש לו תוחלת חיים של 57 ± 3 ימים1,3. משך המחזור הממוצע של התאים של האדם נע בין 16-48 h בהתאם לתנאי התרבות4. יש עדויות לכך שהיכולת המאובדית והאיכות הפונקציונלית של הגידולים הראשוניים העיקריים מתפקדים לרעה עם גיל התורם, ומציעה שתורמים צעירים יותר (בעלי חיים או חולים) צריכים להיות מועדפים אם אפשרי5,6 .
פיברותקיעות מהווים סוג תא דומיננטי של רוב ממחטות הגוף. למרות הנוכחות שלהם בכל מקום, הזיהוי המולקולרי של הפיברופיצוצים הוא עדיין אתגר7. פיברותקיעות להגר לפתח רקמות ואיברים ממקורות שונים במהלך פיתוח עובריים8. מסיבה זו, יש שפע של מסמן חלבונים שניתן למצוא בתוך פיברובפיצוצים בעוד החלבונים סמן ייחודי, אשר נמצאים בכל אוכלוסיית הפיברומה ובלעדית לפיברותקיעות, עדיין חסרים. לפיכך, דפוסי ביטוי של מספר סמנים מזוהים משמשים בדרך כלל כדי לזהות פיברומופיצוצים. בין הסמנים המוכרים ביותר הם vimentin, חלבון הקרקע האדם פיברוההדף (hfsp), discoidin התחום קולטן 2 (DDR2) ו אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA).
פיברותקיעות הם מטריצת החילוץ העיקרית (ECM)-הפקת סוג תא. ובכך, הפיברובטות שומרות על ארכיטקטורת רקמה מסודרת ומספקות תמיכה מכנית לתאים שכנים1. האיזון בין סינתזה של ECM לבין השפלה הוא תהליך מוסדר היטב. משמרות לכיוון הסינתזה לסמן את תחילתה של התצהיר ECM מוגזמת אשר, אם לא הסתיים, מוביל פיברוזיס. פיברוזיס מתווכת על ידי מיופיברופיצוצים, אשר מקורם פיברופיצוצים המופעלות שעברו מולקולרית שינויים פנופי. אחד סימן ההיכר של מיופיברופיצוצים הוא הפרשה משופרת של ECM ו ציטוקינים ואת הביטוי של מסודר מסודרים αSMA מיקרופילטרים9.
פיברותקיעות הראשי כבר בזרקור של מחקר האחרונות התמקדות פיברוזיס, דלקת רקמות ופיברוהפיצוץ-תאים לסרטן-cell10,11. עם זאת, כדי ללמוד ביעילות תכונות פיברובלסט בריאות ומחלות, יש צורך לבודד פיברוהפיצוצים הראשוניים למבוגרים על בסיס קבוע. ישנן מספר שיטות זמין כדי לבודד פיברופיצוצים12,13,14. שלוש השיטות המרכזיות של בידוד פיברובלסט הן התרחבות מנתחי רקמות12, עיכול הרקמה האנזימטית15, ופרזיה אנזימטית של איברים חלולים9,13,16. היתרון של הצמיחה החוצה הוא תהליך בידוד עדין ללא השפלה תא אנזימטי. מצד שני, תרבויות מחוץ לצמיחה דורשים בדרך כלל תקופות התרבות ממושך עד התאים יכולים לשמש ניסויים. מהירות העיכול הנפוצה היא מהירה אך נושאת סיכון לזיהום עם סוגי תאים אחרים (למשל, תאי האנדותל) או חיידקים בתהליך העצבנות, הנחוץ לפזר מכנית את הרקמה. יתרה מזאת, שיטות אלה מורכבות לעתים קרובות ודורשות זמן ומיומנות ללמוד.
בנוגע לחשיבות הגידולים הראשוניים במחקר, עדיין יש צורך למטב את הגישות הקיימות של בידוד התא במונחים של זריזות, פשטות ואמינות. כאן, שיטת בידוד אנזימטית מבוססת על-קולי ומספקת תאים באיכות גבוהה מסופק.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהשוואה לקווי התאים המושווים פיברוהפיצוץ, הפיברופיצוצים העיקריים מציעים מספר יתרונות. הם יכולים להיות מבודדים עלות בצורה יעילה באיכות גבוהה וכמות. יתר על כן, תרבויות העיקרי להציע את האפשרות ללמוד תאים מאנשים מרובים, אשר מגביר את האמינות של התוצאות המתקבלות ומקטין את הסבירות של רק לימוד ח…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לגב רומי קמפה וגב ‘ נט אופץ ‘ לתמיכה טכנית מקצועית. אנו מודים גם למר ביוארן בינניורג. על כך שהוא תומך עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ-a) Förderkreis Dresdner Herz-קראסלאוף-e.V., ב) “הבליטבליםתוכניות לעלמה”, הפקולטה לרפואה קרל גוסטב קאר דרזדן ו-c) אחרים Kröner-פורשיסקולאג (EKFK) הפקולטה לרפואה קרל גוסטב . כרמלה דרסדן . אנו אסירי תודה על המימון והתמיכה
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
Referências
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed – NCBI Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019)
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
