Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Summary

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l’agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Abstract

I fibroblasti adulti primari sono diventati uno strumento importante per studiare la fibrosi, le interazioni con fibroblasti e l’infiammazione in tutti i tessuti del corpo. Poiché i fibroblasti primari non possono dividersi a tempo indeterminato a causa della differenziazione del miofibroblasto o dell’induzione della senescenza, è necessario stabilire regolarmente nuove culture. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare durante i processi di sviluppo di un protocollo di isolamento affidabile e di isolamento fibroblasto primario stesso: il grado di difficoltà del metodo (soprattutto per i principianti), il rischio di contaminazione batterica, il tempo necessario fino a quando i fibroblasti primari possono essere utilizzati per gli esperimenti, e la successiva qualità cellulare e vitalità. In questo studio, viene fornito un protocollo veloce, affidabile e facile da imparare per isolare e coltura fibroblasti adulti primari dal cuore del topo, polmone, fegato e rene che combinano la digestione enzimatica e l’agitazione ultrasonica.

Introduction

I fibroblasti sono cellule piatte a forma di mandrino con molteplici processi stellati e un ampio reticolo endoplasmico ruvido^1,2. Un fibroblasto medio misura 30 – 100 m e ha una durata di vita di 57 x 3 giorni^1,3. La durata media del ciclo cellulare dei fibroblasti umani varia da 16 a 48 h a seconda delle condizioni di coltura⁴. È dimostrato che la capacità replicativa e la qualità funzionale dei fibroblasti primari coltivati sono correlatrici negativamente con l’età del donatore, suggerendo che i donatori più giovani (animali o pazienti) dovrebbero essere preferiti, se possibile,^5,6 .

I fibroblasti costituiscono un tipo di cellula predominante della maggior parte dei tessuti del corpo dei mammiferi. Nonostante la loro presenza onnipresente, l’identificazione molecolare dei fibroblasti è ancora una sfida⁷. I fibroblasti migrano verso lo sviluppo di tessuti e organi provenienti da diverse fonti durante lo sviluppo embrionale⁸. Per questo motivo, c’è una pletora di proteine marcatore che possono essere trovate nei fibroblasti, mentre le proteine marcatore uniche, che sono presenti in ogni popolazione di fibroblasti ed esclusive per i fibroblasti, sono ancora mancanti. Pertanto, i modelli di espressione di diversi marcatori riconosciuti sono di solito utilizzati per identificare i fibroblasti. Tra i marcatori più riconosciuti sono vimentina, proteina superficiale del fibroblasto umano (hFSP), recettore del dominio discoidina 2 (DDR2) e actinmuscolare alfa liscio ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

I fibroblasti sono il principale tipo di cellule che producono matrici extracellulari (ECM). Di conseguenza, i fibroblasti mantengono un’architettura ordinata dei tessuti e forniscono supporto meccanico per le cellule vicine¹. L’equilibrio tra sintesi e degradazione ECM è un processo ben regolato. I spostamenti verso la sintesi segnano l’inizio di un’eccessiva deposizione di ECM che, se non terminata, porta alla fibrosi. La fibrosi è mediata dai miofibroblasti, che provengono da fibroblasti attivati sottoposti a cambiamenti molecolari e fenotipici. Un segno distintivo di miofibroblasti è una maggiore secrezione di ECM e citochine e l’espressione di microfilamenti sMA ordinati⁹.

I fibroblasti primari sono stati sotto i riflettori di una recente ricerca incentrata sulla fibrosi, l’infiammazione dei tessuti e le interazioni fibroblasto-cancro-cellula^10,11. Tuttavia, per studiare efficacemente le proprietà del fibroblasto in salute e malattia, è necessario isolare regolarmente i fibroblasti adulti vitali. Ci sono diversi metodi disponibili per isolare i fibroblasti^12,13,14. I tre principali metodi di isolamento del fibroblasto sono la crescita dai pezzi di tessuto¹², la digestione del tessuto enzimatico¹⁵e la perfusione ezimatica degli organi cavi^9,13,16. Il vantaggio della crescita è un processo di isolamento delicato senza degradazione cellulare enzimatica. D’altra parte, le colture di escrescenza di solito richiedono periodi di coltura prolungati fino a quando le cellule possono essere utilizzate per gli esperimenti. La digestione enzimatica comune è veloce, ma comporta un rischio di contaminazione con altri tipi di cellule (ad esempio, cellule endoteliali) o batteri nel processo di agitazione, che è necessario per sciogliere meccanicamente il tessuto. Inoltre, questi metodi sono spesso elaborati e richiedono tempo e abilità per imparare.

Per quanto riguarda l’importanza dei fibroblasti primari nella ricerca, è ancora necessario ottimizzare gli approcci esistenti di isolamento cellulare in termini di rapidità, semplicità e affidabilità. Qui, viene fornito un nuovo metodo di isolamento eziblasto etcimo basato su ultrasuoni che fornisce cellule di alta qualità.

Protocol

Il seguente protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali della Technische Universitat Dresden, in Germania (numero di file: T 2014/4) e le linee guida per la cura degli animali accettate a livello internazionale (FELASA)17. Figura 1 visualizza il processo di isolamento delle celle. 1. Preparazione dell’impostazione, del materiale e dei supporti Preparare il mezzo di coltura cellulare, soluzione PBS, la s…

Representative Results

È stata dimostrata la capacità di questo protocollo di isolare i fibroblasti adulti dal tessuto murino solido. Sono stati ottenuti fibroblasti vitali che potrebbero essere utilizzati per esperimenti successivi come l’immunofluorescenza colorazione o gli esperimenti di proliferazione (Figura 2D-F, Figura 5A). I fibroblasti adulti sono cellule piatte a forma di mandrino con più processi cellulari che…

Discussion

Rispetto alle linee cellulari fibroblaste immortale, i fibroblasti primari offrono diversi vantaggi. Possono essere isolati in modo conveniente in alta qualità e quantità. Inoltre, le colture primarie offrono la possibilità di studiare cellule da più individui, il che aumenta l’affidabilità dei risultati ottenuti e diminuisce la probabilità di studiare semplicemente gli artefatti della coltura cellulare. La generazione continua di nuove culture primarie previene le alterazioni genetiche che si verificano comunement…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 ml
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577