Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Summary

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Abstract

Os fibroblastos adultos primários tornaram-se uma importante ferramenta para estudar fibrose, interações fibroblásticas e inflamação em todos os tecidos do corpo. Desde que os fibroblastos preliminares não podem dividir indefinidamente devido à diferenciação do Miofibroblasto ou à indução da senescência, as culturas novas devem ser estabelecidas regularmente. No entanto, existem vários obstáculos a superar durante os processos de desenvolvimento de um protocolo de isolamento confiável e isolamento primário de fibroblastos: o grau de dificuldade do método (especialmente para iniciantes), o risco de contaminação bacteriana, o tempo necessário até que os fibroblastos primários possam ser utilizados para experimentos, e subsequente qualidade e viabilidade celular. Neste estudo, um protocolo rápido, confiável e fácil de aprender para isolar e cultura fibroblastos adultos primários do coração do mouse, pulmão, fígado e rim combinando digestão enzimática e agitação ultra-sônica é fornecido.

Introduction

Os fibroblastos são células planas, em forma de fuso, com múltiplos processos de stellate e um retículo endoplasmático áspero^1,2. Um fibroblasto médio mede 30-100 μm e tem uma esperança de vida de 57 ± 3 dias^1,3. A duração média do ciclo celular de fibroblastos humanos varia de 16-48 h, dependendo das condições de cultura⁴. Há evidências de que a capacidade replicativa e a qualidade funcional dos fibroblastos primários cultivados se correlacionam negativamente com a idade do doador, sugerindo que os doadores mais jovens (animais ou pacientes) devam ser preferidos se possível^5,6 .

Os fibroblastos constituem um tipo de célula predominante da maioria dos tecidos corporais de mamíferos. Apesar de sua presença onipresente, a identificação molecular dos fibroblastos ainda é um desafio⁷. Os fibroblastos migram para desenvolver tecidos e órgãos de diferentes fontes durante o desenvolvimento embrionário⁸. Por esta razão, há uma pletora de proteínas do marcador que podem ser encontradas nos fibroblasto visto que as proteínas originais do marcador, que estão atuais em cada população do fibroblasto e exclusivas para fibroblastos, são ainda ausentes. Assim, os padrões de expressão de vários marcadores reconhecidos são geralmente usados para identificar fibroblastos. Entre os marcadores mais reconhecidos estão vimentina, proteína de superfície fibroblástica humana (hfsp), receptor de domínio filhote 2 (DDR2) e actina de músculo liso alfa (αsma).

Os fibroblastos são os principais tipos de células produtoras de matriz extracelular (ECM). Assim, os fibroblastos mantêm uma arquitetura de tecido ordenada e fornecem suporte mecânico para as células vizinhas¹. O equilíbrio entre a síntese e a degradação do ECM é um processo bem regulado. Os deslocamentos para a síntese marcam o começo do depósito excessivo do ECM que, se não terminado, conduz à fibrose. A fibrose é mediada por miofibroblastos, que se originam de fibroblastos ativados submetidos a alterações moleculares e fenotípicas. Uma indicação dos miofibroblastos é secretion realçado do ECM e dos citocinas e a expressão de microfilamentos arranjados ordenadamente de αsma⁹.

Os fibroblastos primários têm sido os holofotes de pesquisas recentes com foco em fibrose, inflamação tecidual e interações fibroblastos-câncer-células^10,11. Entretanto, para estudar eficazmente Propriedades do fibroblasto na saúde e na doença, é necessário isolar fibroblastos adultos preliminares viáveis em uma base regular. Existem vários métodos disponíveis para isolar os fibroblastos^12,13,14. Os três principais métodos de isolamento de fibroblastos são o crescimento dos pedaçosde tecido¹², a digestão enzimática do tecido¹⁵e a perfusão enzimática de órgãos ocos^9,13,16. A vantagem do crescimento é um processo de isolamento suave sem degradação celular enzimática. De um lado, as culturas do conseqüência exigem geralmente períodos prolongados da cultura até que as pilhas possam ser usadas para experiências. A digestão enzimática comum é rápida, mas tem um risco de contaminação com outros tipos de células (por exemplo, células endoteliais) ou bactérias no processo de agitação, o que é necessário para dissolver mecanicamente o tecido. Além disso, esses métodos são muitas vezes elaborados e exigem tempo e habilidade para aprender.

Em relação à importância dos fibroblastos primários na pesquisa, ainda há a necessidade de otimizar as abordagens de isolamento de células existentes em termos de rapidez, simplicidade e confiabilidade. Aqui, um novo método de isolamento de fibroblastos enzimáticos baseados em ultra-som que fornece células de alta qualidade é fornecido.

Protocol

O seguinte protocolo segue as diretrizes institucionais de cuidados com os animais da Technische Universität Dresden, Alemanha (número do arquivo: T 2014/4), bem como as diretrizes de cuidados com os animais internacionalmente aceites (FELASA)17. A Figura 1 visualiza o processo de isolamento da célula. 1. preparando a configuração, material e mídia Prepare o meio de cultura celular, solução de PBS, solução de estoque de …

Representative Results

A habilidade deste protocolo de isolar fibroblasto adultos do tecido murino contínuo foi demonstrada. Foram obtidos fibroblastos viáveis que poderiam ser utilizados para experimentos subsequentes, como coloração por imunofluorescência ou experimentos de proliferação (Figura 2D-F, Figura 5A). Os fibroblastos adultos são células planas em forma de eixo com múltiplos processos celulares que tip…

Discussion

Comparado às linhas de pilha imortalizado do fibroblasto, os fibroblastos preliminares oferecem diversas vantagens. Eles podem ser isolados custo efetivamente em alta qualidade e quantidade. Além disso, as culturas primárias oferecem a possibilidade de estudar células de múltiplos indivíduos, o que aumenta a confiabilidade dos resultados obtidos e diminui a probabilidade de meramente estudar artefatos de cultura celular. A geração contínua de novas culturas primárias previne alterações genéticas que comument…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
Antibiotics	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)
Cell culture hood	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
Cell culture plates	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	depends on vessel	6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC professional suction
Cell strainer (mesh)	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm Nylon
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
Cordless pipetting controller	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
Disposable pipette tips	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl)
Disposable plastic pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	depends on volume	5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml
Disposable sterile scalpel	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	High glucose
Eppendorf tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	depends on volume	50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
Collagenase blend	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 ml
Senescence detection kit	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
Shaker/ Vortex	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)
Ultrasonic water bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic)	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
Surgical scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
Surgical forceps	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577