Ультразвуковое дополненное первичное взрослое фибробластновая изоляция
Summary
Мы представляем протокол для изолировать первичные фибробласты для взрослых простым, быстрым и надежным способом, выполняемым новичками (например, студентами). Процедура сочетает в себе ферментативное пищеварение тканей и механическое возбуждение с ультразвуковыми волнами для получения первичных фибробластов. Протокол можно легко адаптировать к конкретным экспериментальным требованиям (например, к тканям человека).
Abstract
Первичные фибробласты для взрослых стали важным инструментом для изучения фиброза, взаимодействия фибробластов и воспаления во всех тканях организма. Поскольку первичные фибробласты не могут делиться бесконечно из-за дифференциации миофибробластов или индукции сенесценции, необходимо регулярно устанавливать новые культуры. Однако в ходе процессов разработки надежного протокола изоляции и первичной изоляции фибробластов существует несколько препятствий: степень сложности метода (особенно для начинающих), риск бактериального загрязнения, требуется время, пока первичные фибробласты могут быть использованы для экспериментов, и последующее качество клеток и жизнеспособность. В этом исследовании, быстрый, надежный и простой в освоении протокол для изоляции и культуры первичных взрослых фибробластов от мыши сердца, легких, печени и почек сочетания ферментативного пищеварения и ультразвукового возбуждения предоставляется.
Introduction
Фибробласты плоские, шпиндель-образные клетки с несколькими процессами стеллатаи обширным грубым эндоплазмическим ретикулумом 1,2. Средний фибробласт измеряет 30 – 100 мкм и имеет продолжительность жизни 57 и 3 дня1,3. Средняя продолжительность клеточного цикла фибробластов человека колеблется от 16до 48 ч в зависимости от условий культуры 4. Имеются данные, свидетельствующие о том, что репликационные возможности и функциональное качество культивируемых первичных фибробластов негативно коррелирует с возрастом донора, что позволяет по возможности предпочесть более молодых доноров (животных или пациентов) по возможности5,6 .
Фибробласты представляют собой преобладающий клеточный тип большинства тканей тела млекопитающих. Несмотря на их повсеместное присутствие, молекулярная идентификация фибробластов по-прежнему является проблемой7. Фибробласты мигрируют к развивающимся тканями органам из разных источников во время эмбрионального развития 8. По этой причине, есть множество маркерных белков, которые могут быть найдены в фибробластах, в то время как уникальные маркерные белки, которые присутствуют в каждой популяции фибробластов и эксклюзивные для фибробластов, по-прежнему отсутствуют. Таким образом, для идентификации фибробластов обычно используются шаблоны выражения нескольких распознаваемых маркеров. Среди наиболее узнаваемых маркеров – виментин, белок поверхности фибробласта человека (hFSP), рецептор домена дискоидин 2 (DDR2) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА).
Фибробласты являются основным внеклеточным матричным (ECM)- производящим тип клетки. Таким образом, фибробласты поддерживают упорядоченную архитектуру тканей и обеспечивают механическую поддержку соседних клеток1. Баланс между синтезом ECM и деградацией является хорошо регулируемым процессом. Сдвиги в сторону синтеза знаменуют собой начало чрезмерного осаждения ECM, которое, если не прекращается, приводит к фиброзу. Фиброз опосредовано миофибробластами, которые происходят из активированных фибробластов, претерпеваемых молекулярными и фенотипическими изменениями. Одной из отличительных черт миофибробластов является усиленная секреция ЭКМ и цитокинов и выражение упорядоченных микрофиламентов9.
Первичные фибробласты были в центре внимания последних исследований упором на фиброз, воспаление тканей и фибробласт-рак-клеток взаимодействий10,11. Однако, чтобы эффективно изучать фибробластные свойства в здоровье и болезни, необходимо изолировать жизнеспособные первичные фибробласты взрослого на регулярной основе. Есть несколько методов, доступных для изоляции фибробластов12,13,14. Три основных метода фибробластной изоляции являются выращение из тканей куски12,ферментативное пищеварение ткани15, и ферментативной перфузии полых органов9,13,16. Преимуществом роста является мягкий процесс изоляции без ферментативной деградации клеток. С другой стороны, культуры роста обычно требуют длительных периодов культуры, пока клетки могут быть использованы для экспериментов. Общее ферментативное пищеварение быстро, но несет риск заражения другими типами клеток (например, эндотелиальными клетками) или бактериями в процессе агитации, что необходимо для механического растворения ткани. Кроме того, эти методы часто являются сложными и требуют времени и навыков, чтобы узнать.
Что касается важности первичных фибробластов в исследованиях, то по-прежнему существует необходимость оптимизации существующих подходов к изоляции клеток с точки зрения быстроты, простоты и надежности. Здесь предоставляется новый ультразвуковой метод ферментатической изоляции фибробластов, обеспечивающий высокое качество клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с увековеченными фибробластными клеточными линиями, первичные фибробласты предлагают несколько преимуществ. Они могут быть изолированы экономически эффективно в высоком качестве и количестве. Кроме того, первичные культуры предлагают возможность изучения клеток у неск…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жу Роми Кемпе и г-жу Аннетта Опица за экспертную техническую поддержку. Мы также благодарим г-на Бьорна Бинневерга за ИТ-поддержку. Эта работа была поддержана грантами от а) Фюрдеркрейс Дрезднер Херц-Крейслауф-Таге е.В., б) “Хабилитацииффдердерпрограмма фюр Фрауэн”, Медицинский факультет Карл Густав Карус Дрезден и с) Эльза Крюнер-Форшунгсколлег (EKFK) Факультет медицины КарлА Гюрюна Карус Дрезден. Мы признательны за финансирование и поддержку.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
Referências
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed – NCBI Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019)
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
