Ultraljud-förstärkt primär vuxen fibroblast isolering
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att isolera primära vuxna fibroblaster på ett enkelt, snabbt och tillförlitligt sätt, framföras av nybörjare (t. ex. studenter). Förfarandet kombinerar enzymatisk vävnad nedbrytning och mekanisk agitation med ultraljud vågor för att få primära fibroblaster. Protokollet kan enkelt anpassas till specifika experimentella krav (t. ex. mänsklig vävnad).
Abstract
Primära vuxna fibroblaster har blivit ett viktigt verktyg för att studera fibros, fibroblast interaktioner och inflammation i alla kroppens vävnader. Eftersom primära fibroblaster inte kan dela på obestämd tid på grund av myofibroblast differentiering eller åldras induktion, nya kulturer måste fastställas regelbundet. Det finns dock flera hinder att övervinna under processerna för att utveckla ett tillförlitligt isolerings protokoll och primär fibroblast isolering själv: metodens svårighetsgrad (särskilt för nybörjare), risken för bakteriell kontaminering, nödvändig tid tills primära fibroblaster kan användas för experiment, och efterföljande cell kvalitet och lönsamhet. I denna studie, en snabb, tillförlitlig och lätt att lära sig protokoll för att isolera och odla primära vuxna fibroblaster från mus hjärta, lungor, lever och njure som kombinerar enzymatisk matsmältning och ultraljud agitation tillhandahålls.
Introduction
Fibroblaster är platta, Spindelformade celler med flera stellate processer och en omfattande grov endoplasmatiska nätmagen1,2. En genomsnittlig fibroblast åtgärder 30-100 μm och har en livslängd på 57 ± 3 dagar1,3. Den genomsnittliga cell cykel varaktigheten av humana fibroblaster varierar från 16-48 h beroende på kulturen villkor4. Det finns belägg för att den replikativa kapaciteten och funktionella kvaliteten hos odlade primära fibroblaster negativt korrelerar med givar åldern, vilket tyder på att yngre donatorer (djur eller patienter) bör föredra om möjligt5,6 .
Fibroblaster utgör en dominerande celltyp av de flesta däggdjurs organ vävnader. Trots sin allestäde närvarande närvaro, molekylära identifiering av fibroblaster är fortfarande en utmaning7. Fibroblaster migrera till att utveckla vävnader och organ från olika källor under embryonal utveckling8. Av denna anledning, det finns en uppsjö av markör proteiner som kan hittas i fibroblaster medan unika markör proteiner, som finns i varje fibroblast population och exklusivt för fibroblaster, saknas fortfarande. Sålunda, uttrycksmönster av flera erkända markörer används vanligtvis för att identifiera fibroblaster. Bland de mest erkända markörer är vimentin, humant fibroblast yta protein (HFSP), discoidin domän receptor 2 (DDR2) och alfa glatt muskel aktin (αsma).
Fibroblaster är den största extracellulära matrix (ECM)-producerande celltyp. Därmed upprätthåller fibroblaster en ordnad vävnads arkitektur och ger mekaniskt stöd för angränsande celler1. Balansen mellan ECM-syntes och nedbrytning är en välreglerad process. Förskjutningar mot syntes markerar början på överdriven ECM-deposition som, om den inte avslutas, leder till fibros. Fibros medieras av myofibroblaster, som härstammar från aktiverade fibroblaster som genomgår molekylära och fenotypiska förändringar. Ett kännetecken för myofibroblaster är förbättrad utsöndring av ECM och cytokiner och uttrycket av ordnad arrangerade αSMA Microfilaments9.
Primära fibroblaster har varit i fokus för ny forskning med fokus på fibros, vävnadsinflammation och fibroblast-cancer-cellinteraktioner10,11. Emellertid, att effektivt studera fibroblast egenskaper i hälsa och sjukdom, det är nödvändigt att isolera livskraftiga primära vuxna fibroblaster på regelbunden basis. Det finns flera metoder som är tillgängliga för att isolera fibroblaster12,13,14. De tre viktigaste metoderna för fibroblast isolering är utväxt från vävnad bitar12, enzymatisk vävnad nedbrytning15, och enzymatisk perfusion av ihåliga organ9,13,16. Fördelen med utväxt är en skonsam isolerings process utan enzymatisk cell nedbrytning. Å andra sidan, utväxt kulturer kräver vanligtvis långvariga odlings perioder tills cellerna kan användas för experiment. Vanlig enzymatisk matsmältning är snabb men bär en risk för kontaminering med andra celltyper (t. ex. endotelceller) eller bakterier i omrörningsprocessen, vilket är nödvändigt för att mekaniskt lösa upp vävnaden. Dessutom är dessa metoder ofta utarbeta och kräver tid och skicklighet att lära.
När det gäller vikten av primära fibroblaster i forskning, det finns fortfarande ett behov av att optimera befintliga cell isolering metoder i termer av snabbhet, enkelhet och tillförlitlighet. Här, en roman ultraljud-baserade enzymatisk fibroblast isoleringsmetod som levererar högkvalitativa celler tillhandahålls.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jämfört med förevigade fibroblast cellinjer, primära fibroblaster erbjuder flera fördelar. De kan vara isolerade kostnadseffektivt i hög kvalitet och kvantitet. Dessutom erbjuder primär kulturer möjligheten att studera celler från flera individer, vilket ökar tillförlitligheten hos de erhållna resultaten och minskar sannolikheten för att enbart studera cellkultur artefakter. Kontinuerlig generering av nya primär kulturer förhindrar genetiska förändringar som vanligtvis inträffar efter upprepad passaging…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar MS Romy Kempe och Mrs. Annett Opitz för expert teknisk support. Vi tackar också Mr Bjoern Binnewerg för IT-stöd. Detta arbete stöddes av bidrag från a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) “Habilitationsförderprogramm für Frauen”, medicinska fakulteten Carl Gustav Carus Dresden och c) Else kröner-Forschungskolleg (EKFK) medicinska fakulteten Carl Gustav Carus Dresden. Vi är tacksamma för finansieringen och stödet.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
Referências
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed – NCBI Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019)
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
