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Neurociência

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

Published: October 16, 2019
doi:
10.3791/59859
,
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science,RIKEN, 2Senior Adviser’s Office, Center for Brain Science,RIKEN

Summary

Chez certains animaux manipulés par des gènes, l’utilisation d’un seul protocole peut ne pas induire la Ltd dans les cellules cérévelaires de Purkinje, et il peut y avoir un écart entre la LTD et l’apprentissage moteur. Plusieurs protocoles sont nécessaires pour évaluer l’induction de LTD chez les animaux manipulés par des gènes. Les protocoles standard sont affichés.

Abstract

La plasticité synaptique fournit un mécanisme d’apprentissage et de mémoire. Pour l’apprentissage moteur cérévelaire, la dépression à long terme (LTD) des transmissions synaptiques des fibres parallèles (PF) aux cellules de Purkinje (PC) est considérée la base pour l’apprentissage de moteur, et les insuffisances de LTD et d’apprentissage de moteur sont observées dans divers animaux manipulés par des gènes. Des ensembles communs d’apprentissage de moteur, tels que l’adaptation du réflexe optokinetic (OKR), le réflexe vestibulaire-oculaire (VOR), et l’essai de rotarod ont été employés pour l’évaluation de la capacité d’apprentissage de moteur. Cependant, les résultats obtenus à partir du termininus gluA2-carboxy modifié knock-in souris ont démontré l’adaptation normale du VOR et de l’OKR, en dépit de l’absence de PF-LTD. Dans ce rapport, l’induction de ltd a été essayée seulement utilisant un type de protocole de stimulation à la température ambiante. Ainsi, les conditions pour induire le LÉve de cervelateur ont été explorées dans les mêmes mutants knock-in utilisant divers protocoles à la température physiologique proche. Enfin, nous avons trouvé des protocoles de stimulation, par lesquels la LTD pourrait être induite chez ces souris manipulées par les gènes. Dans cette étude, un ensemble de protocoles sont proposés pour évaluer l’induction de LTD, qui permettra plus précisément l’examen de la relation causale entre LTD et l’apprentissage moteur. En conclusion, les conditions expérimentales sont cruciales lors de l’évaluation de la LTD chez les souris manipulées par des gènes.

Introduction

L’organisation synaptique des réseaux neuronaux élaborés du cortex céréco-rebelle, composé de PC, d’interneurons de couche moléculaire (cellules de panier et de stellate), de cellules de Golgi, de PFdes des cellules granules, de fibres moussues et de fibres d’escalade (CFs), ont été élucidées en termes d’excitation/inhibition et de divergence/convergence, et le diagramme de circuits bien organisé a suggéré que le cervelet est une « machine neuronale »1,bien qu’il n’y ait aucune idée auparavant du but de cette « machine ». Plus tard Marr a proposé que l’entrée des PC aux PC constituent un réseau d’apprentissage associatif à trois couches2. Il a également suggéré que chaque FC transmette une instruction cérébrale pour le mouvement élémentaire2. Il a supposé que l’activation simultanée des PF set et des CF augmenterait l’activité de synapse de PF-PC, et causerait la potentialisation à long terme (LTP) de la synapse de PF-PC. D’autre part, Albus a supposé que l’activation synchrone des PF et des FC a entraîné l’ILD aux synapses PF-PC3. Les deux études ci-dessus interprètent le cervelet comme un dispositif de mémoire unique, dont l’incorporation dans le réseau cortical cérécolar conduit à la formation du modèle de machine d’apprentissage Marr-Albus.

Suivant ces prédictions théoriques, deux lignes de preuve suggèrent la présence de plasticité synaptique dans le cervelet. La première ligne de preuve a été suggérée par l’organisation anatomique du flocculus; ici les voies MF d’origine vestibulaire d’organe et les voies de CF d’origine rétinienne convergent sur les PC4. Ce modèle unique de convergence suggère qu’une plasticité synaptique se produisant dans le flocculus cause l’adaptabilité remarquable du réflexe vestibulo-oculaire. Deuxièmement, l’enregistrement de la réponse des PC dans le flocculus et le lésion du flocculus étayaient également l’hypothèse ci-dessus5,6,7. En outre, le modèle de décharge de PC pendant l’adaptation du mouvement de main d’un singe8 a soutenu l’hypothèse de plasticité synaptique, particulièrement Albus’s LTD-hypothesis3.

Pour déterminer la nature de la plasticité synaptique directement, la stimulation conjonctive répétée (Cjs) d’un faisceau de PFets et le CF qui intériorise spécifiquement le PC in vivo a été montré pour induire LTD pour l’efficacité de transmission des synapses PF-PC9, 10,11. Dans les explorations in vitro suivantes utilisant une tranche de cervelateur12 et des PC cultivés, conjonction de la stimulation co-cultivée de cellules de granule et de stimulation de cellules d’olive13 ou conjonction du glutamate et somatique appliqués iontophoretically dépolarisation14,15 causé LTD. Le mécanisme de transduction de signal sous-jacent à l’induction LTD a également été intensivement étudié à l’aide de préparations in vitro16,17.

Les adaptations du VOR et de l’OKR ont souvent été utilisées pour l’évaluation quantitative des effets de manipulation des gènes sur l’apprentissage moteur céréreux, parce que le cortex vestibule-cérévelateur s’est avéré être l’origine essentielle de l’apprentissage adaptatif du VOR18 ,19,20 et l’OKR19,21 La corrélation entre l’échec de l’induction de LTD et l’affaiblissement de l’apprentissage moteur comportemental a été prise comme preuve que LTD joue un rôle essentiel dans le moteur mécanismes d’apprentissage22. Ces points de vue sont collectivement appelés l’hypothèse LTD de l’apprentissage moteur, ou Marr-Albus-Ito hypothèse23,24,25,26.

L’apprentissage adaptatif du mouvement des yeux a été mesuré à l’aide de protocoles similaires, tandis que diverses conditions expérimentales ont été utilisées pour induire ltd dans la préparation des tranches27,28,29,30,31 . Récemment, Schonewille et coll.26 ont signalé que certaines souris manipulées par des gènes ont démontré un apprentissage moteur normal, mais que les tranches de cérévelateur n’ont pas montré de LTD, et ont ainsi conclu que la Ltd n’était pas essentielle à l’apprentissage moteur. Cependant, l’induction de ltd n’a été tentée qu’en utilisant un type de protocole à température ambiante. Par conséquent, nous avons utilisé plusieurs types de protocoles ltd-induisant dans des conditions d’enregistrement à environ 30 oC, et nous avons confirmé que le LTD a été induit de façon fiable chez les souris manipulées par les gènes en utilisant ces protocoles à des températures physiologiques proches32.

Cependant, il reste quelques questions concernant les propriétés de base de la stimulation conjonctive. La première est la relation entre la forme de la pointe complexe et l’amplitude de LTD. Deuxièmement, en conjonction avec PF-stimulation et dépolarisation somatique, si le nombre de stimuli utilisés étaient nécessaires ou non était insaisissable. Dans la présente étude, ces questions ont été étudiées à l’aide de souris de type sauvage (WT).

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité RIKEN sur le soin et l’utilisation des animaux dans les expériences. Les souris ont été gardées dans les installations animales du RIKEN Center for Brain Science sous une température bien contrôlée (23-25 oC) et de l’humidité (45 % à 65 %) Conditions. Des souris mâles et femelles de WT (C57BL/6, 3-6 mois) ont été employées. 1. Préparation des solutions utilisées dans les expériences <p class="jove_con…

Representative Results

Quatre protocoles ont été employés dans cette étude pour induire le CErebellar LTD. Dans les deux premiers protocoles (protocole 1 et 2), la conjonction de la stimulation PF et de la stimulation de la fibrose kystique a été appliquée dans des conditions de pince séminude. Dans les deux autres protocoles (protocole 3 et 4), la dépolarisation somatique a été remplacée par la stimulation de la fibrose kystique dans des conditions de tension-clamp. Des traces de tension ou de courant-traces pendant la stimulation…

Discussion

Différences entre les quatre protocoles

Dans les protocoles ltd-induisant 1 et 2, Cjs 300 fois à 1 Hz est suffisant pour induire le cervelateur LTD. La fréquence de stimulation des FC semblait être dans une gamme physiologique, parce que le taux de tir de pointe complexe chez les souris adultes alertes (P60) a été rapporté pour être 1.25 Hz36. Cependant, la stimulation des FC seule n’a pas causé de plasticité à long terme dans la synapse PF-CF, comme utilisé d…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions A. Oba pour son assistance technique. Cette recherche a été partiellement appuyée par Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 à K.Y.

Materials

Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078
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Referências

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Citar este artigo
Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).
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