Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto
Summary
In alcuni animali manipolati dai geni, l’utilizzo di un unico protocollo potrebbe non indurre LTD nelle cellule cerebellar Purkinje, e ci può essere una discrepanza tra LTD e apprendimento motorio. Sono necessari più protocolli per valutare l’induzione di LTD in animali manipolati dal gene. Vengono visualizzati i protocolli standard.
Abstract
La plasticità sinaptica fornisce un meccanismo per l’apprendimento e la memoria. Per l’apprendimento motorio cerebellare, la depressione a lungo termine (LTD) delle trasmissioni sinaptiche dalle fibre parallele (PF) alle cellule Purkinje (PC) è considerata la base per l’apprendimento motorio, e le carenze di LTD e di apprendimento motorio sono osservate in vari animali manipolati dal gene. Per la valutazione della capacità di apprendimento motorio, sono stati utilizzati set comuni di apprendimento motorio, come l’adattamento del riflesso ottimale (OKR), il riflesso vestibolare-oculare (VOR) e il test di rotazione. Tuttavia, i risultati ottenuti dal capolinea GluA2-carboxy modificato topi knock-in hanno dimostrato il normale adattamento del VOR e della OKR, nonostante la mancanza di PF-LTD. In tale relazione, l’induzione di LTD è stata tentata utilizzando un solo tipo di protocollo di stimolazione a temperatura ambiente. Così, le condizioni per indurre cerebellar LTD sono state esplorate negli stessi mutanti knock-in utilizzando vari protocolli a temperatura quasi fisiologica. Infine, abbiamo trovato protocolli di stimolazione, mediante i quali la LTD potrebbe essere indotta in questi topi manipolati dai geni. In questo studio, viene proposta una serie di protocolli per valutare l’induzione di LTD, che consentirà più accuratamente l’esame della relazione causale tra LTD e apprendimento motorio. In conclusione, le condizioni sperimentali sono cruciali nella valutazione di LTD in topi manipolati dai geni.
Introduction
L’organizzazione sinaptica delle elaborate reti neuronali della corteccia cerebellare, composta da PC, interneuroni a strato molecolare (cellule da canestro e stellate), cellule di Golgi, PF da cellule granule, fibre muschioe e fibre rampicanti (CF), sono state chiarite in termini di eccitazione/inibizione e divergenza/convergenza, e il diagramma del circuito ben organizzato ha suggerito che il cervelletto è una “macchina neuronale”1, anche se in precedenza non c’era idea dello scopo di questa “macchina”. Successivamente Marr propose che l’input di PF per i PC costituisca una rete di apprendimento associativo a triplo strato2. Suggerì anche che ogni CF trasmette un’istruzione cerebrale per il movimento elementale2. Ha assunto che l’attivazione simultanea di FR e CF avrebbe migliorato l’attività di sinapsi PF-PC, e causare potenziamento a lungo termine (LTP) della sinapsi PF-PC. D’altra parte, Albus ha ritenuto che l’attivazione sincrona di GIF e CF ha portato a LTD presso le sinapsi PF-PC3. Entrambi gli studi di cui sopra interpretano il cervelletto come un dispositivo di memoria unico, la cui incorporazione nella rete corticale cerebellare porta alla formazione del modello di machine di apprendimento del modello Marr-Albus.
Seguendo queste previsioni teoriche, due linee di prova suggeriscono la presenza di plasticità sinaptica nel cervelletto. La prima linea di prova è stata suggerita dall’organizzazione anatomica del flocculus; qui le vie MF di origine dell’organo vestibolare e le vie CF di origine retinica convergono sui PC4. Questo modello di convergenza unico suggerisce che una plasticità sinaptica che si verifica nel flocculus provoca la notevole adattabilità del riflesso vestibulo-oculare. In secondo luogo, la registrazione dei PC risposta nel flocculus e la lesioning del flocculus anche sostenuto l’ipotesi di cui sopra5,6,7. Inoltre, il modello di scarico del PC durante l’adattamento del movimento della mano di una scimmia8 ha sostenuto l’ipotesi della plasticità sinaptica, in particolare l’ipotesi LTD di Albus3.
Per determinare direttamente la natura della plasticità sinaptica, la stimolazione congiuntiva ripetuta (Cjs) di un fascio di GIF e della CF che in particolare innervail i minattici il PC in vivo è stato dimostrato a LTD indurre per l’efficacia della trasmissione delle sinapsi PF-PC9, 10,11. Nelle successive esplorazioni in vitro con una fetta cerebellare12 e PC coltivati, congiunzione di stimolazione cellulare granulo co-coltivata e stimolazione delle cellule ulivi13 o congiunzione di glutammato e somatica depolarizzazione14,15 ha causato LTD. Anche il meccanismo di trasduzione del segnale alla base dell’induzione del LTD è stato studiato intensamente utilizzando preparati in vitro16,17.
Gli adattamenti del VOR e dell’OKR sono stati spesso utilizzati per la valutazione quantitativa degli effetti di manipolazione genica sull’apprendimento motorio cerebellare, perché la corteccia vestibule-cerebellare è stata dimostrata come l’origine essenziale nell’apprendimento adattivo del VOR18 ,19,20 e L’OKR19,21 La correlazione tra il fallimento dell’induzione di LTD e la compromissione dell’apprendimento motorio comportamentale è stata presa come prova che LTD svolge un ruolo essenziale nel motore meccanismi di apprendimento22. Queste opinioni sono collettivamente indicate come l’ipotesi LTD dell’apprendimento motorio, o ipotesi Marr-Albus-Ito23,24,25,26.
L’apprendimento adattivo del movimento oculare è stato misurato utilizzando protocolli simili, mentre varie condizioni sperimentali sono state utilizzate per indurre LTD nella preparazione delle fette27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 ha riferito che alcuni topi manipolati dai geni hanno dimostrato un normale apprendimento motorio, ma le fette di cerebellar non mostravano LTD, e quindi hanno concluso che ltd non era essenziale per l’apprendimento motorio. Tuttavia, l’induzione di LTD è stata tentata utilizzando un solo tipo di protocollo a temperatura ambiente. Quindi, abbiamo utilizzato diversi tipi di protocolli che inducono LTD in condizioni di registrazione a circa 30 gradi centigradi, e abbiamo confermato che il LTD è stato indotto in modo affidabile nei topi manipolati dai geni utilizzando questi protocolli a temperature quasi fisiologiche32.
Tuttavia, rimangono alcune domande riguardanti le proprietà di base della stimolazione congiuntiva. Il primo è la relazione tra la forma del picco complesso e l’ampiezza di LTD. In secondo luogo, in combinazione con la stimolazione PF e la depolarizzazione somatica, se il numero di stimoli utilizzati erano necessari o meno era inafferrato. Nel presente studio, queste domande sono state studiate utilizzando topi di tipo selvaggio (WT).
Protocol
Representative Results
Discussion
Differenze tra i quattro protocolli
Nei protocolli di induzione di LTD 1 e 2, Cjs 300 volte a 1 Hz è sufficiente per indurre cerebellar LTD. Frequenza di stimolazione della CF sembrava essere in una gamma fisiologica, perché il complesso tasso di cottura picco nei topi adulti di allarme (P60) è stato segnalato per essere 1.25 Hz36. Tuttavia, la stimolazione CF da sola non ha causato plasticità a lungo termine nella sinapsi PF-CF, come utilizzato nei protocolli 1 e 2 (…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo A. Oba per la sua assistenza tecnica. Questa ricerca è stata parzialmente supportata da Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 a K.Y.
Materials
| Amplifier | Molecular Devices-Axon | Multiclamp 700B | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | BF150-110-10 | |
| Digitizer | Molecular Devices-Axon | Digidata1322A | |
| Electrode puller | Sutter | Model P-97 | |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 26675-46-7 | |
| Isolator | A.M.P.I. | ISOflex | |
| Linear slicer | Dosaka EM | PRO7N | |
| Microscope | NIKON | Eclipse E600FN | |
| Peristaltic pump | Gilson | MP1 Single Channel Pump | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Pure water maker | Merck-Millipore | MilliQ 7000 | |
| Software for experiment | Molecular probe-Axon | pClamp 10 | |
| Software for statistics | KyensLab | KyPlot 5.0 | |
| Stimulator | WPI | DS8000 | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 1078 |
Referências
- Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. . The Cerebellum as a Neuronal Machine. , (1967).
- Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
- Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
- Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
- Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
- Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
- Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
- Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
- Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
- Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
- Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
- Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
- Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
- Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
- Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
- Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
- Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
- Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
- Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
- Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
- van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
- Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
- De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
- Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
- Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
- Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
- Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
- Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
- Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
- Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
- Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
- De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
- Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
- Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
- Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
- Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
- Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
- Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
- Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
- Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
- Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
- Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
- Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).
