इस लेख में विस्तार से अटलांटिक सामन में सूक्ष्म खनिज उपलब्धता का आकलन करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण बताते हैं । पद्धति में बढ़ती जैविक जटिलता के साथ उपकरण और मॉडल शामिल हैं: (1) रासायनिक विशिष्टता विश्लेषण, (2) इन विट्रो घुलनशीलता, (3) सेल लाइनों में तेज अध्ययन, और (4) वीवो मछली अध्ययन में।
आहार सूक्ष्म खनिजों की उपलब्धता का आकलन मछली प्रजातियों के खनिज पोषण में एक बड़ी चुनौती है। वर्तमान लेख का उद्देश्य अटलांटिक सामन(साल्मो सालार)में जिंक (जेडएन) की उपलब्धता का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों के संयोजन के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करना है। यह देखते हुए कि कई Zn रासायनिक प्रजातियों एक अटलांटिक सामन फ़ीड में मौजूद हो सकता है, यह परिकल्पना की गई थी कि Zn उपलब्धता फ़ीड में मौजूद Zn रासायनिक प्रजातियों से प्रभावित है । इस प्रकार, इस अध्ययन में, पहला प्रोटोकॉल इस बारे में है कि विभिन्न जेडएन रासायनिक प्रजातियों को फ़ीड से कैसे निकाला जाए और आकार के बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी-प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसईसी-आईसीपी-एमएस) विधि से उनका विश्लेषण किया जाए। इसके बाद, अटलांटिक सामन फीड में आहार जेडएन की घुलनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो विधि विकसित की गई थी। तीसरा प्रोटोकॉल इंद्रधनुष ट्राउट आंत सेल लाइन (आरटगुटजीसी) का उपयोग करके मछली आंतों के एपिथेलियल मॉडल में जेडएन रासायनिक प्रजातियों की संरचना को बदलने के प्रभाव का अध्ययन करने की विधि का वर्णन करता है। एक साथ, इन विट्रो तरीकों से निष्कर्षों की तुलना वीवो अध्ययन में अटलांटिक सामन फीड के पूरक जेडएन के अकार्बनिक और कार्बनिक स्रोतों की स्पष्ट उपलब्धता की जांच के साथ की गई थी । परिणामों से पता चला है कि कई Zn रासायनिक प्रजातियों फ़ीड में पाया जा सकता है और एक कार्बनिक Zn स्रोत की दक्षता अमीनो एसिड ligand के लिए chelate Zn इस्तेमाल पर बहुत ज्यादा निर्भर करता है । इन विट्रो विधियों के निष्कर्षों का वीवो अध्ययन में उस परिणाम से कम संबंध था । फिर भी, इस लेख में वर्णित इन विट्रो प्रोटोकॉल ने जेडएन उपलब्धता और मछली फ़ीड में इसके आकलन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की।
मछली भोजन और मछली के तेल पारंपरिक रूप से अटलांटिक सामन फ़ीड में इस्तेमाल किया गया । हालांकि, इन अवयवों को तेजी से पौधे आधारित सामग्री द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा है1। फीड कंपोजीशन में उपरोक्त बदलाव के परिणामस्वरूप आहार की कम उपलब्धता हुई है और अटलांटिक सामन फीड, विशेष रूप से जिंक (जेडएन)2में खनिज उपलब्धता में सुधार की आवश्यकता बढ़ गई है। कम उपलब्धता जेडएन स्तर, जेडएन रासायनिक प्रजातियों या/और आहार मैट्रिक्स में मौजूद कुपोषण कारकों में बदलाव का परिणाम हो सकता है । इस परिदृश्य में, सामान्य रूप से ‘कार्बनिक स्रोतों’ के रूप में विचार किए जाने वाले एडिटिव्स की एक नई सरणी मछली के लिए आहार खनिजों का एक बेहतर उपलब्ध स्रोत होने की क्षमता के साथ उभरी है। इसलिए, खनिजों की उपलब्धता और मछली के लिए उनके स्रोतों को नियंत्रित करने वाले मौलिक रसायन विज्ञान और शरीर विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण है। जिंक सभी जीवों के लिए एक आवश्यक अनु ट्रेस तत्व है3. सिग्नलिंग अणु के रूप में जेडएन की भूमिका का वर्णन मछली4में पैरासेलुलर और इंट्रासेलुलर दोनों स्तर पर किया गया है । अटलांटिक सामन में, जेडएन की कमी कंकाल असामान्यताओं और विभिन्न जेडएन धातुविज्ञान5,6की कम गतिविधि से जुड़ी हुई है।
यह अध्ययन विभिन्न रासायनिक और जैविक जटिलता के चार विभिन्न डिब्बों में वर्गीकृत करके जेडएन उपलब्धता को समझने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करता है। इसमें शामिल तरीकों को चार खंडों में वर्णित किया गया है, जैसा कि चित्र 1 में देखा जा सकता है:(1) एक अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश में Zn रासायनिक प्रजातियों का मूल्यांकन एक आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके-प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसईसी-आईसीपी-एमएस) विधि7; (2) अटलांटिक सामन फ़ीड में पूरक Zn की विट्रो घुलनशीलता; (3) मूल्यांकन Zn रासायनिक प्रजातियों में विट्रो आंतों मॉडल (RTgutGC)8द्वारा तेज; और (4) अटलांटिक सामन(साल्मो सालार)9में Zn की स्पष्ट उपलब्धता । इसी तरह के प्रोटोकॉल जलकृषि मछली प्रजातियों के लिए पोषण हित के अन्य खनिजों (जैसे, मैंगनीज, सेलेनियम, तांबा) के लिए विकसित किए जा सकते हैं।
जेडएन का आंतों का अवशोषण13जेडएन प्रजाति के रासायनिक रूप से प्रभावित प्रतीत होता है . इस संबंध में, इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के उपयोग ने अटलांटिक सामन में जेडएन की ‘उपलब्धता’ में अंतर्निहित रासायनिक और जैविक पहलुओं के क्रमिक अध्ययन की अनुमति दी।
इस अध्ययन में जेडएन स्पेसाइजेशन विश्लेषण विधि के उपयोग की सूचना दी गई। एसईसी-आईसीपी-एमएस विधि ने अटलांटिक सामन फीड के घुलनशील अंश में मौजूद जेडएन रासायनिक प्रजातियों के आणविक वजन से संबंधित गुणात्मक डेटा प्रदान किया । यह आणविक वजन अंशांकन मानकों (यानी, थायरोग्लोबुलिन (660 केडीए), जेडएन/सीयू सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटेज (32 केडीए), मायोग्लोबिन (17 केडीए) और विटामिन बी 12 (1.36 केडीए) के अवधारण समय की तुलना में हासिल किया गया था जिसमें चोटियों वाले ज़ैन के अवधारण समय थे। जेडएन स्पेसिफिकेशन एनालिसिस में मिली एक चुनौती विश्लेषणात्मक मानकों की कमी के कारण अज्ञात जेडएन रासायनिक प्रजातियों की पहचान थी । एसईसी में, अणुओं का पृथक्करण स्थिर चरण में छिद्रों के सापेक्ष उनके आकार पर आधारित होता है। सिद्धांत रूप में, बड़े अणु तेजी से यात्रा करेंगे, पहले eluting, और छोटे अणुओं धीमी यात्रा करेंगे, बाद में14eluting । नतीजतन, प्रत्येक जेड युक्त चोटी में समान आणविक वजन15के साथ कई यौगिक हो सकते हैं। यह अज्ञात जेडएन रासायनिक प्रजातियों की पहचान करने की चुनौती में भी योगदान देता है। इसके अलावा, जेडएन निकालने के लिए कई हल्के निष्कर्षण स्थितियों का परीक्षण किया गया था। निकाले गए Zn कम (~ 10%) जेडएन रासायनिक प्रजातियों को अक्षुण्ण रखने के लिए हल्के निष्कर्षण की स्थिति लागू की गई थी लेकिन इससे निष्कर्षण दक्षता7से समझौता हो सकता है ।
इन विट्रो घुलनशीलता परख में, पूरक जेडएन (रेडियो आइसोटोप 65जेडएनसीएल2के रूप में) की घुलनशीलता ने संकेत दिया कि अमीनो एसिड, विशेष रूप से हिस्टिडीन और लिसाइन, जेडएन(चित्रा 5)की घुलनशीलता में वृद्धि हुई। नकली गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थितियों के तहत इन विट्रो घुलनशीलता के लिए सीधे फीड नमूनों का उपयोग करना इस ज्ञान पर आधारित है कि जेडएन विशिष्टता में परिवर्तन पीएच निर्भरहै 16। हालांकि, जीआई पथ की शुरुआत में अम्लीय स्थितियों के परिणामस्वरूप विशिष्टता में कुछ परिवर्तन हो सकते हैं जो अपरिवर्तनीय हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, जेडएनओ-> जेडएनएल2,पेट में अम्लीय परिस्थितियों में एचसीएल की उपस्थिति में)। फिर भी, यहां उपयोग किया जाने वाला जेडएन स्रोत जेडएनएसओ4 है और जिसकी घुलनशीलता को माध्यम में अमीनो एसिड द्वारा सुधारा गया था। अगले सवाल का जवाब दिया जाना था, क्या बढ़ी हुई घुलनशीलता का उपलब्धता में अनुवाद किया जा सकता है? इस प्रश्न का अध्ययन करने के लिए आरटगुटजीसी आंतों की कोशिका रेखा का उपयोग किया गया था। जानवरों में खनिज पोषण के संदर्भ में, ‘उपलब्धता’ शब्द को परिभाषित करना कठिन है और जानवर (वीवो में) की तुलना में कोशिकाओं (इन विट्रो) में अंतर से विनियमित किया जा सकता है। इसलिए, जब आंतों की सेल लाइन का उपयोग करके इन विट्रो मूल्यांकन की बात आती थी तो ‘तेज’ शब्द का उपयोग किया जाता था। सेल लाइन ने आंतों के एपिथेलियम में जेडएन तेज तंत्र पर उपयोगी जानकारी प्रदान की जो जटिल नियामक प्रक्रिया का हिस्सा है जो जानवरों में खनिज उपलब्धता को नियंत्रित करता है। आरटगुटजीसी कोशिकाओं ने अमीनो एसिड (यानी, मेथिओनिन) की उपस्थिति में जेडएन के एपिकल तेज के लिए बेहतर क्षमता प्राप्त की; चित्रा 6)। हालांकि, वीवो में स्पष्ट उपलब्धता अटलांटिक सामन में अकार्बनिक और कार्बनिक Zn स्रोतों के बीच काफी अलग नहीं थी। वीवो उपलब्धता अध्ययन में, Zn स्रोत तुलना आहार Zn स्तर पर अच्छी तरह से अटलांटिक सामन17, १५०मिलीग्राम/किलो फ़ीड के कुल Zn एकाग्रता के ज्ञात Zn आवश्यकताओं से अधिक किया गया था । उपलब्धता में अंतर बेहतर कल्पना कर रहे है जब आहार के स्तर का परीक्षण रैखिक गतिशील रेंज में गिरावट से पहले पशु संतृप्ति तक पहुंचता है । वीवो अध्ययन में वर्तमान में, यह संभव है कि अटलांटिक सामन अच्छी तरह से इस्तेमाल स्रोतों के बीच Zn अवशोषण में अंतर मनाया संतृप्त थे ।
संक्षेप में, पहली विधि ने अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश में पाई जाने वाली विभिन्न जेडएन रासायनिक प्रजातियों के बारे में गुणात्मक जानकारी प्रदान की; दूसरी विधि, अमीनो एसिड लिगामेंट्स की उपस्थिति में पूरक जेडएन की इन विट्रो घुलनशीलता में सुधार किया गया था; तीसरी विधि ने पुष्टि की कि अमीनो एसिड द्वारा बेहतर घुलनशीलता आंतों के एपिथेलियम में तेज में सुधार कर सकती है; इसके विपरीत, चौथी विधि अकार्बनिक या कार्बनिक स्रोत से अटलांटिक सामन के लिए Zn की उपलब्धता में अंतर खोजने में विफल रहा । समाप्त करने के लिए, हालांकि वीवो निष्कर्षों के साथ संरेखण में नहीं, इन विट्रो प्रोटोकॉल ने जेडएन उपलब्धता के विभिन्न घटकों को समझने में दिलचस्प अंतर्दृष्टि प्रदान की।
The authors have nothing to disclose.
यह काम परियोजना APREMIA (स्पष्ट उपलब्धता और अटलांटिक सामन में खनिजों की आवश्यकता, अनुदान संख्या २४४४९०) नार्वे अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित के तहत किया गया था ।
0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
0.45 μm membrane filter | Pall | ||
10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
Experimental fish feeds | Skretting | ||
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
Pasteur pipette | VWR | ||
pH meter | inoLab | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
Zinc sulphate | Vilomix |