Denna artikel förklarar i detalj ett systematiskt tillvägagångssätt för att bedöma tillgången på mikromineral i atlantlax. Metoden omfattar verktyg och modeller med ökande biologisk komplexitet: 1) kemisk speciationsanalys, (2) in vitro-löslighet, (3) upptagsstudier i cellinjer och (4) in vivo-fiskstudier.
Att bedöma tillgången på mikromineraler via kosten är en stor utmaning inom mineralnäring av fiskarter. Denna artikel syftar till att beskriva ett systematiskt tillvägagångssätt som kombinerar olika metoder för att bedöma tillgången på zink (Zn) i atlantlax(Salmo salar). Med tanke på att flera Zn kemiska arter kan finnas i ett atlantiskt laxfoder, var det hypotesen att Zn tillgänglighet påverkas av Zn kemiska arter som finns i fodret. Således, i denna studie, det första protokollet handlar om hur man extraherar de olika Zn kemiska arterna från foderet och att analysera dem med en storlek uteslutning kromatografi-induktivt kopplade plasma massa spektroskopi (SEC-ICP-MS) metod. Därefter utvecklades en in vitro-metod för att utvärdera lösligheten hos kosten Zn i atlantiska laxfoder. Det tredje protokollet beskriver metoden för att studera effekten av att ändra Zn kemiska arters sammansättning på upptaget av Zn i en fisk intestinal epitelial modell med hjälp av en regnbåge tarm cellinje (RTgutGC). Tillsammans jämfördes resultaten från in vitro-metoderna med en in vivo-studie som undersökte den uppenbara tillgången på oorganiska och ekologiska källor till Zn kompletterade med atlantlaxfoder. Resultaten visade att flera Zn kemiska arter finns i matar och effektiviteten hos en organisk Zn källa beror mycket på aminosyra ligand används för att kelat Zn. Resultaten av in vitro-metoderna hade mindre korrelation med resultatet av in vivo-studien. In vitro-protokoll som beskrivs i denna artikel gav dock viktig information om Zns tillgänglighet och dess bedömning i fiskfoder.
Fiskmjöl och fiskolja användes traditionellt i atlantlaxfoder. Dessa ingredienser ersätts dock alltmer av växtbaserade ingredienser1. Den ovannämnda förändringen i fodersammansättningen har resulterat i låg tillgång på kosten och ett ökat behov av att förbättra mineraltillgången i atlantlaxfoder, särskilt zink (Zn)2. Den minskade tillgängligheten kan bero på en förändring av Zn-nivån, Zn kemiska arter eller/och antinutritional faktorer som finns i fodermatrisen. I detta scenario har en ny rad tillsatser som allmänt betraktas som “organiska källor” uppstått med potential att vara en bättre tillgänglig källa till dietmineraler att fiska. Därför är det viktigt att förstå grundläggande kemi och fysiologi som styr tillgången på mineraler och deras källor till fisk. Zink är ett viktigt spårämne för alla levande organismer3. Zns roll som signalmolekyl har beskrivits på både paracellulär och intracellulär nivå hos fisk4. I atlantlax har Zn brist associerats med skelettet avvikelser och minskad aktivitet av olika Zn metalloenzymes5,6.
Denna studie beskriver ett systematiskt tillvägagångssätt för att förstå Zn tillgänglighet genom att kategorisera den i fyra olika fack av varierande kemisk och biologisk komplexitet. De berörda metoderna beskrivs i fyra avsnitt, vilket kan ses i figur 1:1) utvärdering av Zn-kemiska arter i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder med hjälp av en storleksuteslutning kromatografi-induktivt kopplade plasmamasspektroskopi (SEC-ICP-MS)metod 7. 2. In vitro-löslighet hos kompletterad Zn i atlantlaxfoder. (3) Utvärdering av Zn kemiska arters upptag genom in vitro-tarmmodell (RTgutGC)8. och (4) Uppenbar tillgång på Zn i atlantlax(Salmo salar)9. Liknande protokoll kan utvecklas för andra mineraler (t.ex. mangan, selen, koppar) av näringsintresse för vattenbruksfiskarter.
Intestinal absorption av Zn verkar påverkas av den kemiska formen av Zn-arten13. I detta avseende gjorde användningen av de protokoll som beskrivs i denna artikel det möjligt att i tur och grad studera de kemiska och biologiska aspekter som ligger till grund för “tillgången” på Zn i atlantlax.
Denna studie rapporterade användningen av en Zn speciation analysmetod. SEC-ICP-MS-metoden tillhandahöll kvalitativa data om molekylvikten hos Zn-kemiska arter som finns i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder. Detta uppnåddes genom jämförelse av retentionstiderna för kalibreringsstandarderna för molekylvikt (dvs. tyroglobulin (660 kDa), Zn/Cu superoxiddemutas (32 kDa), myoglobin (17 kDa) och vitamin B12 (1,36 kDa)) med retentionstiderna för Zn som innehåller toppar. En utmaning som hittades i Zn speciation analys var identifiering av den okända Zn kemiska arten på grund av brist på analytiska standarder. I SEC är separationen av molekylerna baserad på deras storlekar i förhållande till porerna i den stationära fasen. I princip kommer större molekyler att färdas snabbare, eluera först och mindre molekyler kommer att färdas långsammare, eluera senare14. Följaktligen kan varje Zn som innehåller topp innehålla flera föreningar med liknande molekylvikt15. Detta bidrar också till utmaningen att identifiera okända Zn kemiska arter. Dessutom testades flera milda extraktionsförhållanden för extraktion av Zn. Den extraherade Zn var låg (~ 10%). Milda extraktionsförhållanden tillämpades för att hålla Zn kemiska arter intakta men detta kan ha äventyrat extraktionseffektiviteten7.
I in vitro-löslighetsanalysen indikerade lösligheten hos kompletterad Zn (som radioisotop 65ZnCl2) att aminosyrorna, särskilt histidin och lysin, ökade Zns löslighet (figur 5). Användning av foderprover direkt för in vitro-löslighetsanalyser under simulerade gastrointestinala förhållanden baseras på vetskapen om att förändringen i Zn-speciation är pH-beroende16. Sura förhållanden i början av mag-tarmkanalen kan dock leda till någon förändring i speciationen som kan vara irreversibel (t.ex. ZnO -> ZnCl2, i närvaro av HCl under sura förhållanden i magen). Ändå är Zn-källan som används här ZnSO4 och vars löslighet förbättrades av aminosyror i mediet. Nästa fråga som skulle besvaras var, kan den ökade lösligheten översättas till tillgänglighet? RTgutGC intestinala cellinjen användes för att studera denna fråga. När det gäller mineralnäring hos djur är termen “tillgänglighet” svår att definiera och kan regleras differentiellt i cellerna (in vitro) jämfört med ett djur (in vivo). Därför användes termen “upptag” när det gällde in vitro-utvärderingen med hjälp av tarmcelllinjen. Cellinjen gav användbar information om Zn-upptagsmekanismerna vid tarmepiteleriet, som är en del av den komplexa regleringsprocessen som styr mineraltillgången hos djur. RTgutGC-cellerna framkallade en bättre kapacitet för apical upptag av Zn i närvaro av en aminosyra (dvs. metionin; Figur 6). Den uppenbara tillgången in vivo skilde sig dock inte nämnvärt mellan oorganiska och ekologiska Zn-källor i atlantlax. I in vivo-tillgänglighetsstudien gjordes Zn-källjämförelsen på Zn-nivåer som låg långt över de kända Zn-kraven för atlantlax17, den totala Zn-koncentrationen på 150 mg/kg foder. Skillnaderna i tillgänglighet visualiseras bättre när de testade kostnivåerna faller i det linjära dynamiska intervallet innan djuret når mättnad. I den aktuella in vivo-studien är det möjligt att atlantlaxen var väl mättad till observerad skillnad i Zn-absorption mellan de källor som användes.
Sammanfattningsvis gav den första metoden kvalitativ information om olika kemiska Zn-arter som finns i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder. den andra metoden, in vitro löslighet av kompletterade Zn förbättrades i närvaro av aminosyra ligands. Den tredje metoden bekräftade att förbättrad löslighet av aminosyror kan förbättra upptaget vid intestinal epitel. Omvänt kunde den fjärde metoden inte hitta skillnader i tillgången på Zn från oorganisk eller ekologisk källa till atlantlax. Sammanfattningsvis, även om de inte var i linje med in vivo-resultaten, gav in vitro-protokollen intressanta insikter om att förstå de olika komponenterna i Zn-tillgängligheten.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete utfördes inom ramen för projektet APREMIA (Apparent availability and requirement of minerals in Atlantic salmon, grant no. 244490) finansierat av Norges forskningsråd.
0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
0.45 μm membrane filter | Pall | ||
10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
Experimental fish feeds | Skretting | ||
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
Pasteur pipette | VWR | ||
pH meter | inoLab | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
Zinc sulphate | Vilomix |