Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays
Summary
Biologisk membran fusion katalyseres af specialiserede fusions proteiner. Måling af proteiner fusogenic egenskaber kan opnås ved lipid blanding assays. Vi præsenterer en metode til rensning af rekombinant Drosophila atlastin, et protein, der medierer homotypisk fusion af ER, og som danner det til præformerede Liposomer og test for fusions kapacitet.
Abstract
Membran fusion er en afgørende proces i den eukaryotiske celle. Specialiserede proteiner er nødvendige for at katalysere fusion. Atlastiner er endoplasmatiske reticulum (ER) hjemmehørende proteiner impliceret i homotypisk fusion af ER. Vi detalje her en metode til rensning af en glutathion S-transferase (GST) og poly-histidine mærkede Drosophila atlastin ved to runder af Affinity kromatografi. Undersøgelse af fusionsreaktioner in vitro kræver, at rensede fusions proteiner indsættes i et lipid-bilag. Liposomer er ideelle model membraner, som lipid sammensætning og størrelse kan justeres. Til dette formål beskriver vi en rekonstitutionsmetode ved fjernelse af vaskemiddel for Drosophila atlastin i præformerede Liposomer. Mens flere rekonstitueringsmetoder er tilgængelige, rekonstitution ved fjernelse af vaskemiddel har flere fordele, der gør det velegnet til atlastiner og andre lignende proteiner. Fordelen ved denne metode omfatter et højt rekonstitutionsudbytte og korrekt orientering af det rekonstituerede protein. Denne metode kan udvides til andre membran proteiner og til andre anvendelser, der kræver proteoliposomes. Derudover beskriver vi en FRET baseret lipid blanding assay af proteoliposomes anvendes som en måling af membran fusion.
Introduction
Membran fusion er en kritisk proces i mange biologiske reaktioner. Under biologiske forhold, membran fusion er ikke spontan og kræver specialiserede fusion proteiner til at katalysere sådanne reaktioner1. Er homotypisk membran fusion er medieret i dyr af dynamin relateret GTPase atlastin2. Atlastin rolle i homotypisk fusion er grundlæggende for tre-vejs vejkryds i perifer ER, som udgør et stort sammenkoblet netværk af tubuler, der strækker sig gennem hele cellen. Atlastins har en bevaret domæne morfologi bestående af en stor GTPase, en tre Helix Bundle midterste domæne, en hydrofobe membran anker, og en kort cytoplasmatiske C-Terminal hale3. In vitro undersøgelser med rekombinant Drosophila atlastin har vist, at når de er rekonstitueret til Liposomer, det bevarer sin fusogenic egenskaber. Andre atlastiner, herunder humane homologer har ikke været i stand til at rekapitulere fusion in vitro. Vi beskriver her en metode til rensning af en GST og poly-histidin Tagged rekombinant Drosophila atlastin, rekonstituerer det til Liposomer, og metaloid fusion.
Undersøgelse membran fusion in vitro udgør en udfordring som fusogenic proteiner normalt har et membran anker. For at studere dem, er det nødvendigt at rekonstruere dem i model lipid bilag. Store unilamellære vesikler (LUV) er et nyttigt redskab til at studere lipid protein interaktioner. Vi præsenterer her et system til at gøre LUVs af forskellige lipid kompositioner for protein rekonstitution og fusion assays. Rekonstitution af Integral proteiner til LUVs kan opnås ved en række forskellige metoder, herunder organisk opløsningsmiddel-medieret rekonstitution, mekaniske mekanismer eller opvaskemiddel assisteret rekonstitution4. Vi præsenterer her en metode til rekonstituering Drosophila atlastin i præformerede Liposomer ved fjernelse af vaskemiddel. Fordelene ved denne rekonstitutionsmetode omfatter høje rekonstitutionsudbytter og korrekt orientering af atlastin i lipid-bilaget. Desuden, gennem denne metode, proteinet er ikke tørret eller udsættes for organiske opløsningsmidler derved opretholde struktur og funktion. Blandt ulemperne kan tilstedeværelsen af vaskemidler ikke være ideelle for alle proteiner, og de endelige proteoliposomer kan have nogle indbyggede vaskemiddel i lipid-bilaget. Yderligere dialyse kan anvendes til at fjerne mere af vaskemidlet. Dialyse kan dog tage lang tid og kan derfor føre til tab af protein aktivitet.
Vurdering af atlastin fusion aktivitet kan bestemmes ved lipid blanding analyser som tidligere beskrevet2. Her afgrænser vi en metode til måling af atlastin medieret fusion gennem N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamin rhodamine-B Methylsulfonylmethan (rhodamine) mærket lipider. Denne analyse kræver fusion af donor (mærket) proteoliposomes og lønarbejdstageren (ikke-mærkede) proteoliposomes. En FRET frigivelse kan måles under reaktionen som fortynding af et donor-acceptor par fra “mærket” Liposomer til “umærkede” Liposomer som følge af lipid blanding under membran fusion (figur 1)5. Mens denne analyse tjener som en proxy for membran fusion, er den begrænset til at skelne mellem membran fusion og hemifusion, en tilstand, hvor kun de ydre foldere blandes. For at løse dette problem, et alternativ er den ydre folder dæmper af NBD af dithionit. Efter den samme metode som NBD/rhodamin lipid blanding assays, ved slukning af den ydre indlægsseddel enhver NBD FRET frigivelse ved fusion vil være på grund af indre folder blanding8.
Alternative fusion analyser af indre vandige indhold blanding adresse fuld fusion kun5. Eksempler på dette er terbium (TB)/dipicolinic Acid (DPA) analyser og Aminonaphthalen trisulfonsyre (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) bromid (DPX)-analyser. I TB/DPA assays, en pulje af Liposomer med indkapslet TB er blandet og fusioneret med Liposomer med indkapslet DPA; ved fusion øges fluorescens via intern energioverførsel fra DPA til TB inden for [TB (DPA)3]3- cheleringkompleks6. I modsætning hertil slukkes ANTS-fluorescens for ANTS/DPX-assays af DPX7. Mens disse systemer adresse indre indhold blanding, mere dybtgående forberedelse af Liposomer er nødvendig for fjernelse af ikke-indkapslede reagenser, samt utilsigtet interaktion af fluorophores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoderne her afgrænser en effektiv metode til at rense, rekonstituere og måle fusion aktivitet af rekombinant atlastin. For at sikre høje udbytter af funktionel atlastin nogle kritiske skridt skal overvejes. Ekspression skal ske ved lave temperaturer (16 °C) for at undgå sammenlægning, og man bør tilstræbe en endelig koncentration på mellem 0,4 – 1,5 mg/mL. Meget fortyndet protein vil ikke blive rekonstitueret optimalt ved et 1:400 protein til lipid ratio. Rekonstitution effektivitet kan eventuelt analyseres …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Michael Stern og hans laboratorium for deres indsigt og feedback på atlastin relaterede projekter. Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] og National Institute of neurologiske lidelser og Stroke [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
Referências
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Bioquímica. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Bioquímica. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Bioquímica. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
