지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성
Summary
생물학적 막 융합은 특수 융합 단백질에 의해 촉매됩니다. 단백질의 fusogenic 특성을 측정하는 것은 지질 혼합 분석을 통해 달성될 수 있다. 우리는 재조합 Drosophila 아틀라를 정화하는 방법을 제시, ER의 상모 융합을 중재하는 단백질, 미리 형성 된 리포솜에 그것을 재구성, 융합 용량에 대한 테스트.
Abstract
막 융합은 진핵 세포에서 중요한 과정입니다. 융합을 촉매하려면 특수 단백질이 필요합니다. 아틀라스틴은 ER의 상동성 융합에 연루된 소포체(ER) 상주 단백질이다. 여기서 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 폴리히스티딘 태그가 붙은 드로소필라 아플라스틴을 친화성 크로마토그래피의 두 라운드로 정화하는 방법을 자세히 설명합니다. 시험관 내에서 융합 반응을 연구하려면 정제된 융합 단백질을 지질 이중층으로 삽입해야 합니다. 리포솜은 지질 조성 및 크기가 조정될 수 있기 때문에 이상적인 모델 막이다. 이를 위해, 우리는 미리 형성 된 리포좀으로 초파리 아플라스틴에 대한 세제 제거에 의해 재구성 방법을 설명합니다. 여러 가지 재구성 방법을 사용할 수 있지만, 세제 제거에 의한 재구성은 아틀라스틴 및 기타 유사한 단백질에 적합한 몇 가지 장점이 있습니다. 이 방법의 장점은 재구성 된 단백질의 높은 재구성 수율 및 올바른 배향을 포함한다. 이 방법은 단백질을 필요로 하는 그밖 막 단백질 및 그밖 용도로 확장될 수 있습니다. 추가적으로, 우리는 막 융합의 측정으로 이용된 프로테올리포좀의 FRET 기반 지질 혼합 분석사를 기술한다.
Introduction
막 융합은 많은 생물학적 반응에서 중요한 과정입니다. 생물학적 조건하에서, 막 융합은 자발적이지 않으며 그러한 반응을 촉매하기위해 전문화된 융합 단백질이 필요합니다 1. ER 상형 막 융합은 다이너닌 관련 GTPase 아플라스틴2에의해 동물에서 매개된다. 상모융합에서 아틀라스틴의 역할은 세포 전체에 걸쳐 확장되는 튜블의 큰 상호 연결된 네트워크를 구성하는 주변 ER의 3방향 접합에 대한 기본입니다. 아틀라스틴은 대형 GTPase, 3개의 나선 번들 중간 도메인, 소수성 멤브레인 앵커 및 짧은 세포질 C-말단 꼬리3으로구성된 보존된 도메인 형태를 가진다. 재조합 드로 소 필아슬아슬라 아플라스틴과 생체 외 연구는 리포솜으로 재구성 할 때, 그것은 그것의 fusogenic 속성을 유지하는 것으로 나타났습니다. 인간 상동체를 포함한 다른 아슬아슬증은 시험관 내에서 융합을 재현할 수 없었다. 우리는 여기에 GST와 폴리 히스티딘 태그 재조합 초파리 아틀라스틴을 정화하기위한 방법론을 설명, 리포솜에 그것을 재구성, 및 융합을 해석.
시험관내에서 막 융합을 연구하는 것은 일반적으로 막 앵커를 가지고 있는 푸소제닉 단백질로서 도전을 제시한다. 그들을 연구하기 위해서는 모델 지질 이중층으로 재구성해야합니다. 큰 unilamellar 소포 (LUV)는 지질 단백질 상호 작용을 공부하는 유용한 공구입니다. 우리는 단백질 재구성 및 융합 세포에 대한 다른 지질 조성물의 LUV를 만드는 시스템을 제시합니다. LuV로 의 통합 단백질의 재구성은 유기 용매 매개 재구성, 기계적 메커니즘, 또는 세제 보조 재구성을포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다 4. 우리는 여기에 세제 제거에 의해 미리 형성 된 리포좀으로 Drosophila 아틀라스틴을 재구성하는 방법을 제시한다. 이 재구성 방법의 장점은 지질 이중층에서 높은 재구성 수율과 아슬라틴의 적절한 방향을 포함한다. 부가적으로, 이 방법을 통해, 단백질은 건조되거나 유기 용매에 노출되지 않아 구조 및 기능을 유지한다. 그 단점 중, 세제의 존재는 모든 단백질에 이상적이지 않을 수 있으며 최종 프로테올리포좀은 지질 이중층에 일부 통합 세제를 가질 수 있다. 추가 투석은 세제의 더 많은 제거하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나 투석은 시간이 오래 걸릴 수 있으므로 단백질 활성의 손실로 이어질 수 있습니다.
아플라스틴의 융합 활성을 평가하는 것은 앞서 설명한 바와 같이 지질 혼합 검사에 의해 결정될 수있다2. 여기서, 우리는 N-(7-니트로벤츠-2-옥사-1,3-디아졸-4-yl(NBD)/리사민 로다민-B 설포닐(로다민)에 표기된 지질을 통해 아플라스틴 매개 융합을 측정하는 방법을 묘사한다. 이 분석법은 기증자 (표지된) 프로테올리포좀및 수용자(표지되지 않은) 프로테올리포좀의 융합을 요구한다. FRET 방출은 막 융합 동안 지질 혼합의 결과로서 “표지된” 리포좀으로부터 “표지된” 리포좀으로부터 공여자-수용자 쌍의 희석으로서 반응동안 측정될 수 있다(도 1)5. 이 분석은 막 융합을 위한 프록시역할을 하는 동안, 막 융합과 헤미퓨전을 구별하는 데 에는 제한적이며, 외부 리플렛만 혼합하는 상태이다. 이 문제를 해결하기 위해, 대안은 디티오미트에 의한 NBD의 외부 전단지 담금질이다. NBD/로다민 지질 혼합 시험과 동일한 방법론에 따라, 외부 리플렛을 담금질하면 융합에 의한 NBD FRET 방출은 내부 리플렛 혼합에 기인할 것이다8.
내부 수성 함량 혼합 주소 전체 융합만5에의한 대체 융합 어제비. 이것의 예는 테르비움 (Tb)/디피콜린산 (DPA) 아미노나페탈렌 트리설포닉산 (ANTS)/p-자일렌 비스 (피리디늄) 브로마이드 (DPX) 애시스입니다. 결핵/DPA 검사에서, 캡슐화 된 결핵을 가진 리포좀 풀은 캡슐화된 DPA와 리포솜과 혼합되고 융합됩니다; 융합시, 형광은 [Tb(DPA) 3]3] 3-킬레이트 복합체6내에서 DPA에서 결핵으로 의 내부 에너지 전달을 통해 증가한다. 대조적으로, ANTS/DPX 어설션의 경우, 개미 형광은 DPX7에의해 담금질됩니다. 이러한 시스템은 내부 콘텐츠 혼합을 해결하는 동안, 리포좀의 더 심층적 인 준비는 비 캡슐화 시약의 제거뿐만 아니라 형광의 의도하지 않은 상호 작용을 위해 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 방법은 재조합 아슬란스틴의 융합 활성을 정화, 재구성 및 측정하기위한 효율적인 방법을 묘사합니다. 기능 적 아플라스틴의 높은 수율을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다. 아슬란스틴의 발현은 응집을 피하기 위해 저온 (16 °C)에서 수행해야하며 0.4-1.5 mg / mL 사이의 최종 농도를 목표로해야합니다. 매우 희석된 단백질은 지질 비율로 1:400 단백질로 최적으로 재구성되?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
마이클 스턴 박사와 그의 연구실에서 아플라스틴 관련 프로젝트에 대한 통찰력과 피드백에 감사드립니다. 이 작품은 일반 의학의 국립 연구소에 의해 지원되었다 [R01GM101377] 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소 [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
Referências
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