Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser
Summary
Biologisk membran fusjon er katalysert av spesialiserte fusjons proteiner. Måle fusogenic egenskaper av proteiner kan oppnås ved lipid miksing analyser. Vi presenterer en metode for rensing av rekombinant Drosophila atlastin, et protein som formidler homotypic fusjon av AKUTTEN, rekonstituering av det til preformed liposomer, og testing for fusjons kapasitet.
Abstract
Membran fusjon er en viktig prosess i den eukaryote cellen. Spesialiserte proteiner er nødvendig for å katalysere fusjon. Atlastins er endoplasmatiske retikulum (er) bosatt proteiner innblandet i homotypic fusjon av AKUTTEN. Vi detalj her en metode for rensing en glutation S-glutamyltransferase (GST) og Poly-histidin merket Drosophila atlastin av to runder av affinitet kromatografi. Studere Fusion reaksjoner in vitro krever renset Fusion proteiner som skal settes inn i en lipid bilayer. Liposomer er ideelle modell membraner, som lipid sammensetning og størrelse kan justeres. For dette formålet beskriver vi en metode for rekonstituering ved rengjøringsmiddel fjerning for Drosophila atlastin til preformed liposomer. Selv om flere metoder for rekonstituering er tilgjengelige, har fjerning av vaskemiddel flere fordeler som gjør den egnet for atlastins og andre lignende proteiner. Fordelen med denne metoden inkluderer en høy rekonstituering yield og riktig orientering av rekonstituert protein. Denne metoden kan utvides til andre membran proteiner og for andre programmer som krever proteoliposomes. I tillegg beskriver vi et bånd basert lipid miksing analysen av proteoliposomes brukes som en måling av membran fusjon.
Introduction
Membran fusjon er en kritisk prosess i mange biologiske reaksjoner. Under biologiske forhold er membran fusjon ikke spontan og krever spesialiserte fusjons proteiner for å katalysere slike reaksjoner1. Er homotypic membran Fusion er mediert i dyr av dynamin relaterte GTPase atlastin2. Atlastin rolle i homotypic fusjon er grunnleggende for treveis kryss i perifer er, som utgjør et stort sammenhengende nettverk av tubuli som strekker seg over hele cellen. Atlastins har en bevart domene morfologi bestående av en stor GTPase, en tre Helix bunt midtre domene, en hydrofobe membran anker, og en kort cytoplasmatiske C-terminal hale3. In vitro studier med rekombinant Drosophila atlastin har vist at når rekonstituert til liposomer, opprettholder den sine fusogenic egenskaper. Andre atlastins, inkludert menneskelige homologs har ikke vært i stand til å recapitulate fusjon in vitro. Vi beskriver her en metodikk for rensing en GST og Poly-histidin merket rekombinant Drosophila atlastin, rekonstituering av det til liposomer, og assaying fusjon.
Studere membran Fusion in vitro presenterer en utfordring som fusogenic proteiner har vanligvis en membran anker. For å studere dem, er det nødvendig å Rekonstituer dem inn i modellen lipid bilayers. Store unilamellære blemmer (LUV) er et nyttig verktøy for å studere lipid protein interaksjoner. Vi presenterer her et system for å gjøre elsker av forskjellige lipid komposisjoner for protein rekonstituering og fusjon analyser. Rekonstituering av Integral proteiner i har kan oppnås ved en rekke metoder, inkludert, organiske løsemiddel-mediert rekonstituering, mekaniske mekanismer, eller vaskemiddel assistert rekonstituering4. Vi presenterer her en metode for rekonstituering av Drosophila atlastin inn preformed liposomer av vaskemiddel fjerning. Fordelene med denne rekonstituering metoden inkluderer høy rekonstituering gir og riktig orientering av atlastin i lipid bilayer. I tillegg, gjennom denne metoden, er proteinet ikke tørket eller utsatt for organiske løsemidler og dermed opprettholde struktur og funksjon. Blant sine ulemper, tilstedeværelsen av vaskemidler kan ikke være ideelt for alle proteiner og den endelige proteoliposomes kan ha noen innarbeidet vaskemiddel i lipid bilayer. Ytterligere dialyse kan brukes til å eliminere mer av vaskemiddel. Men dialyse kan ta lang tid og kan derfor føre til tap av protein aktivitet.
Vurdering atlastin ‘ s Fusion aktivitet kan bestemmes av lipid miksing analyser som tidligere beskrevet2. Her, vi avgrense en metode for å måle atlastin mediert fusjon gjennom N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-YL (neste arbeidsdag)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) merket lipider. Denne analysen krever fusjon av donor (merket) proteoliposomes og Acceptor (umerkede) proteoliposomes. En bånd Release kan måles under reaksjonen som fortynning av en giver-Acceptor par fra “merket” liposomer til “umerkede” liposomer som et resultat av lipid miksing under membran fusjon (figur 1)5. Mens denne analysen fungerer som en proxy for membran fusjon, er det begrenset i skille mellom membran fusjon og hemifusion, en tilstand der bare de ytre brosjyrer mix. For å løse dette problemet, er et alternativ ytre pakningsvedlegget slukker av neste arbeidsdag ved dithionite. Etter den samme metodikk som neste arbeidsdag/rhodamine lipid blande analyser, ved å slukke den ytre pakningsvedlegget noen arbeidsdag bånd utgivelse ved fusjon vil være på grunn av indre pakningsvedlegg blanding8.
Alternative fusjon analyser av indre vandig innhold miksing adresse full fusjon bare5. Eksempler på dette er Terbium (TB)/dipicolinic acid (DPA) analyser og aminonaphthalene trisulfonic acid (ANTS)/p-xylene BIS (pyridinium) bromide (DPX) analyser. I TB/DPA-analyser blir en pool av liposomer med innkapslet TB blandet og smeltet sammen med liposomer med innkapslet DPA. ved fusjon økes fluorescens via intern energi overføring fra DPA til TB i [TB (DPA)3]3- Chelation Complex6. Til sammenligning, for ANTS/DPX-analyser, er ANTS-fluorescens slukket av DPX7. Selv om disse systemene adresserer blanding av indre innhold, er det nødvendig med mer dybde utarbeidelse av liposomer for fjerning av ikke-innkapslet reagenser, i tillegg til utilsiktet interaksjon av fluorophores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene her avgrense en effektiv metode for rensing, rekonstituering av, og måle fusjon aktivitet av rekombinant atlastin. For å sikre høy avkastning av funksjonell atlastin noen kritiske skritt må vurderes. Atlastin må gjøres ved lave temperaturer (16 ° c) for å unngå aggregering, og man bør sikte på en endelig konsentrasjon mellom 0,4 – 1.5 mg/mL. Svært fortynnet protein vil ikke bli rekonstituert optimalt på et 1:400 protein til lipid ratio. Effektiviteten av rekonstituering kan eventuelt analyseres me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Michael Stern og hans Lab for deres innsikt og tilbakemeldinger på atlastin relaterte prosjekter. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] og National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
Referências
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Bioquímica. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Bioquímica. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Bioquímica. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
