Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus
Summary
Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.
Abstract
Uno de los principales obstáculos en el campo de la investigación de vesículas extracelulares (EV) hoy en día es la capacidad de lograr preparaciones de EV purificadas en un entorno de infección viral. El método presentado está destinado a aislar los vehículos eléctricos lejos de los viriones (es decir, VIH-1), lo que permite una mayor eficiencia y rendimiento en comparación con los métodos de ultracentrifugación convencionales. Nuestro protocolo contiene tres pasos: precipitación EV, separación de gradiente de densidad y captura de partículas. Los ensayos aguas abajo (es decir, Western blot y PCR) se pueden ejecutar directamente después de la captura de partículas. Este método es ventajoso sobre otros métodos de aislamiento (es decir, ultracentrifugación) ya que permite el uso de volúmenes de inicio mínimos. Además, es más fácil de usar que los métodos alternativos de aislamiento EV que requieren múltiples pasos de ultracentrifugación. Sin embargo, el método presentado está limitado en su alcance de ensayos de EV funcionales, ya que es difícil eluir los vehículos eléctricos intactos de nuestras partículas. Además, este método se adapta a un entorno estrictamente basado en la investigación y no sería comercialmente viable.
Introduction
La investigación centrada en vesículas extracelulares (EV), específicamente exosomas, un tipo de EV que va de 30-120 nm y se caracteriza por la presencia de tres marcadores de tetraspanrina CD81, CD9 y CD63, ha sido moldeada en gran medida por el desarrollo de métodos para aislar y purificar las vesículas de interés. La capacidad de diseccionar mecanismos multifacéticos se ha visto obstaculizada debido a técnicas complejas y que consumen mucho tiempo que generan muestras compuestas por una población heterogénea de vesículas generadas a través de diferentes vías con una amplia gama de contenidos, tamaños y Densidades. Si bien esto es un problema para casi todas las investigaciones de vehículos eléctricos, es de particular importancia cuando se estudian los vehículos eléctricos en el contexto de la infección viral, ya que los viriones y partículas similares a virus (VLP) pueden ser similares en diámetro a las vesículas de interés. Por ejemplo, el Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1) tiene aproximadamente 100 nm de diámetro, que es aproximadamente del mismo tamaño que muchos tipos de vehículos eléctricos. Por esta razón, hemos diseñado un nuevo flujo de trabajo de aislamiento EV para abordar estos problemas.
El estándar de oro actual de aislamiento EV es ultracentrifugación. Esta técnica hace uso de las diversas densidades vesículas, lo que permite separar las vesículas por centrifugación con sedimentación diferencial de partículas de mayor densidad frente a partículas de menor densidad en cada etapa 1,2. Se requieren varias etapas de centrifugación de baja velocidad para eliminar las células intactas (300-400 x g durante 10 min), los desechos celulares (2.000 x g durante 10 min) y los cuerpos apoptóticos/vesículas grandes (10.000 x g durante 10 min). Estas purificaciones iniciales son seguidas por la ultracentrifugación de alta velocidad (100,000-200,000 x g para 1.5-2 h) a los vehículos eléctricos sedimentados. Los pasos de lavado se realizan para asegurar aún más la pureza ev, sin embargo, esto resulta en la reducción del número de vehículos eléctricos aislados, reduciendo así el rendimiento total 3,4. La utilidad de este método está limitada aún más por el requisito de un gran número de celdas (aproximadamente 1 x 108) y un gran volumen de muestra (> 100 ml) para lograr resultados adecuados.
Para abordar las crecientes preocupaciones, la precipitación de vesículas con polímeros hidrófilos se ha convertido en una técnica útil en los últimos años. El polietilenglicol (PEG), u otros reactivos de precipitación relacionados, permite al usuario bajar las vesículas, virus y agregados de proteína o proteína-ARN dentro de una muestra simplemente incubando la muestra con el reactivo de elección, seguido de un solo valor de baja velocidad centrifugación1,2,5. Hemos informado previamente que el uso de PEG o métodos relacionados para precipitar los vehículos eléctricos en comparación con los resultados tradicionales de ultracentrifugación en un rendimiento significativamente mayor6. Esta estrategia es rápida, fácil, no requiere equipos caros adicionales, es fácilmente escalable y retiene la estructura EV. Sin embargo, debido a la naturaleza promiscua de este método, las muestras resultantes contienen una variedad de productos, incluyendo proteínas libres, complejos proteicos, una gama de vehículos eléctricos y viriones que requieren una mayor purificación para obtener la población deseada1 ,2,7,8.
Para superar la heterogeneidad de los vehículos eléctricos obtenidos a partir de diversos métodos de precipitación, la ultracentrifugación de gradiente de densidad (DG) se utiliza para separar mejor las partículas en función de su densidad. Este método se lleva a cabo utilizando un gradiente escalonado utilizando un medio de gradiente de densidad, como iodixanol o sacarosa, que permite la separación de los vehículos eléctricos de proteínas, complejos proteicos y partículas similares a virus (VLP). Es importante señalar que, si bien una vez se pensó que la DG permitía una separación más precisa de las subpoblaciones de vehículos eléctrico, ahora se sabe que los tamaños y densidades de varias vesículas pueden superponerse. Por ejemplo, se sabe que los exosomas tienen densidades de flotación de 1,08-1,22 g/mL9,mientras que las vesículas aisladas del Golgi (COPI+ o clathrin+) tienen densidades de 1,05-1,12 g/ml y las del retículo endoplasmático (COPII+ ) sedimento sin 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Además, si uno desea comparar fracciones exosomales con fracciones que contienen partículas virales, esto puede llegar a ser más difícil dependiendo de la densidad del virus de interés, hay virus distintos del VIH-1 que probablemente se equilibran al mismo tiempo densidades como fracciones positivas exosómicas2.
Por último, el enriquecimiento de los preparativos de EV para la visualización posterior y los ensayos funcionales es vital para la investigación de vehículos eléctrico. El uso de nanopartículas enriquecedoras de EV, específicamente partículas de hidrogel multifuncionales que miden 700-800 nm de diámetro, son un paso crítico para lograr preparaciones concentradas del EV. Poseen un cebo aromático de alta afinidad que encapsulado por una concha de tamizado exterior poroso para promover la selectividad. Las nanopartículas utilizadas en este estudio incluyen dos preparaciones distintas con diferentes cebos de núcleo (Reactivo Rojo 120 NT80; y Cibacron Azul F3GA NT82) que han demostrado aumentar la captura de vehículos eléctricos de diversos reactivos y biofluidos (ver la Tabla de Materiales )6,10,11,12,13,14,15. Las partículas ofrecen un fácil enriquecimiento de los vehículos eléctricos de numerosos materiales de partida, incluyendo fracciones de iodixanol, sobrenadante de cultivo celular, así como biofluidos del paciente como plasma, suero, fluidos cefalorraquídeos (CSF) y orina6,13 .
El método presentado aquí mejora la eficiencia de las técnicas actuales de purificación de EV mediante la combinación de varias tecnologías; Precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas, para agilizar el flujo de trabajo, reducir los requisitos de la muestra y aumentar el rendimiento para obtener una muestra de EV más homogénea para su uso en toda la investigación ev. Este método es particularmente útil en la investigación de los vehículos eléctricos y su contenido durante la infección viral, ya que incluye un paso de filtración de 0,22 m para excluir vesículas y VLP grandes y no deseadas y la separación de la población total de vehículos eléctricos en función de la densidad para aislar los vehículos eléctricos de los viriones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito permite mejorar el rendimiento de los vehículos eléctricos y la separación del virus de los vehículos eléctricos mediante un enfoque combinado para el aislamiento. Las cantidades relativamente grandes de material de partida (es decir, sobrenadante celular) se pueden filtrar antes del aislamiento del EV por precipitación, separación DG y enriquecimiento de nanopartículas, lo que resulta en un volumen final de 30 ol, lo que permite un uso inmediato en una variedad de ensayos aguas abajo. El uso …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio de Kashanchi, especialmente a Gwen Cox. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 y NS099029 a F.K.).
Materials
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1X) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14x89mm | Beckman Coulter | 344059 |
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