Rensning af ekstracellulære vesikulære præparater med høj udbytte afstand fra virus

Summary

Denne protokol isolerer ekstracellulære vesikler (EVs) væk fra virions med høj effektivitet og udbytte ved at indarbejde EV nedbør, tæthed gradient ultracentrifugering, og partikel opsamling for at muliggøre en strømlinet arbejdsgang og en reduktion af start volumen krav, hvilket resulterer i reproducerbare præparater til brug i al forskning i EV.

Abstract

En af de store forhindringer i området for ekstracellulær vesikelprotein (EV) forskning i dag er evnen til at opnå renset EV præparater i en viral infektion indstilling. Den præsenterede metode er beregnet til at isolere EVs væk fra virions (dvs., HIV-1), giver mulighed for en højere effektivitet og udbytte i forhold til konventionelle ultracentrifugering metoder. Vores protokol indeholder tre trin: EV nedbør, tæthed gradient adskillelse, og partikel opsamling. Downstream-assays (dvs., Western blot, og PCR) kan køres direkte efter partikel opsamling. Denne metode er fordelagtig i forhold til andre isolations metoder (dvs. ultracentrifugering), da den gør det muligt at anvende minimale start volumener. Desuden er det mere brugervenlig end alternative EV isolation metoder, der kræver flere ultracentrifugering trin. Men den præsenterede metode er begrænset i sit omfang af funktionelle EV assays, da det er vanskeligt at elueres intakt EVS fra vores partikler. Desuden er denne metode skræddersyet til en strengt forskningsbaseret indstilling og vil ikke være kommercielt levedygtig.

Introduction

Forskning centreret omkring ekstracellulære vesikler (EVs), specielt exosomer, en type af EV spænder 30-120 nm og karakteriseret ved tilstedeværelsen af tre tetraspanin markører CD81, CD9, og CD63, er i vid udstrækning blevet formet af udviklingen af metoder til at isolere og rense de vesikler af interesse. Evnen til at dissekere mangesidede mekanismer er blevet hæmmet på grund af komplekse og tidskrævende teknikker, der genererer prøver bestående af en heterogen population af vesikler genereret via forskellige veje med en bred vifte af indhold, størrelser og Tætheder. Selv om dette er et problem for næsten alle EV forskning, det er af særlig betydning, når man studerer EVs i forbindelse med viral infektion, som virions og virus-lignende partikler (VLPs) kan være ens i diameter til vesikler af interesse. For eksempel er humant immundefekt virus type 1 (HIV-1) ca. 100 nm i diameter, hvilket er omtrent samme størrelse som mange typer EVs. Derfor har vi udviklet en ny EV-isolations arbejdsgang for at løse disse problemer.

Den nuværende guld standard af EV isolation er ultracentrifugering. Denne teknik gør brug af de forskellige vesikale tætheder, som gør det muligt at separere vesikler ved centrifugering med differentiel sedimentering af højere densitet partikler versus nedre tæthed partikler på hver etape ^1,2. Der kræves flere Centrifugerings trin med lav hastighed for at fjerne intakte celler (300-400 x g i 10 minutter), cellerester (~ 2.000 x g i 10 min) og apoptotiske organer/store vesikler (~ 10.000 x g i 10 min). Disse indledende rensninger efterfølges af højhastigheds ultracentrifugering (100000-200000 x g for 1,5-2 timer) til sediment evt. Vaske trin udføres for yderligere at sikre EV renhed, men dette resulterer i reduktionen af antallet af isolerede EVS, hvilket sænker det samlede udbytte ^3,4. Denne metodes nytte er yderligere begrænset af kravet om et stort antal celler (ca. 1 x 10⁸) og et stort prøvevolumen (≫ 100 ml) for at opnå tilstrækkelige resultater.

For at imødegå de voksende bekymringer, er udfældning af vesikler med hydrofile polymerer blevet en nyttig teknik i de seneste år. Polyethylenglycol (PEG) eller andre relaterede nedfældnings reagenser gør det muligt for brugeren at trække vesikler, vira og protein-eller protein-RNA-aggregater i en prøve ved blot at inkube prøven med den foretrukne reagens efterfulgt af en enkelt lavhastigheds centrifugering^1,2,5. Vi har tidligere rapporteret, at brugen af PEG eller relaterede metoder til at udfældes EVs i forhold til traditionelle ultracentrifugering resultater i et betydeligt højere udbytte⁶. Denne strategi er hurtig, nem, kræver ikke ekstra dyrt udstyr, er let skalerbar, og bevarer EV struktur. Men på grund af den promiøse karakter af denne metode, de resulterende prøver indeholder en række produkter, herunder frie proteiner, protein komplekser, en række EVs, og virions dermed kræver yderligere rensning for at opnå den ønskede population^{1 ,2,7,8}.

For at overvinde den heterogenitet af EVs opnået fra forskellige nedbør metoder, tæthed gradient ultracentrifugering (DG) udnyttes til bedre at adskille partikler baseret på deres tæthed. Denne metode udføres ved hjælp af en trinvis gradient ved hjælp af en tæthed gradient medium, såsom iodixanol eller saccharose, som giver mulighed for adskillelse af EVs fra proteiner, protein komplekser, og virus eller virus-lignende partikler (Vlp’er). Det er vigtigt at bemærke, at selv om det engang var tanken, at GD tillod en mere præcis adskillelse af EV-delpopulationer, er det nu kendt, at størrelser og tætheder af forskellige vesikler kan overlappe hinanden. For eksempel vides det, at exosomer har flotations tætheder på 1,08-1.22 g/ml⁹, mens vesikler isoleret fra Golgi (Copi⁺ eller clathrin⁺) har en tæthed på 1,05-1.12 g/ml og dem fra endoplasmatiske reticulum (copii⁺ ) sediment ved 1,18-1,25 g/ml^1,2,3,4,9. Desuden, hvis man ønsker at sammenligne exosomale fraktioner mod fraktioner, der indeholder virale partikler, kan dette blive vanskeligere afhængigt af tætheden af virus af interesse-der er vira andre end HIV-1, der sandsynligvis ækvibrere på samme tæthed som exosomale positive fraktioner².

Endelig er berigelse af EV-Preps for downstream-visualisering og funktionelle analyser afgørende for EV-forskningen. Brugen af EV-berigende nanopartikler, specifikt, multi-funktionelle hydrogel partikler, der spænder 700-800 nm i diameter, er et afgørende skridt i at opnå koncentrerede EV Preps. De besidder en høj affinitet aromatisk agn, som indkapslet af en porøs ydre sigtige Shell til at fremme selektivitet. De nanopartikler, der anvendes i denne undersøgelse, omfatter to særskilte præparater med forskellige kerne lomidler (reaktiv rød 120 NT80; og Cibacron Blue F3GA NT82), som har vist sig at øge indfangningen af EVs fra forskellige reagenser og biofluider (Se tabellen over materialer )^{6,10,11,12,13,14,15}. Partiklerne giver let berigelse af EVS fra talrige udgangsmaterialer, herunder iodixanol fraktioner, cellekultur supernatant, samt patientens biofluider såsom plasma, serum, cerebrale spinal væsker (CSF), og urin^6,13 .

Den metode, der præsenteres her, forbedrer effektiviteten af de nuværende EV rensningsteknikker ved at kombinere flere teknologier; EV nedbør, tæthed gradient ultracentrifugering, og partikel opsamling, at strømline arbejdsprocessen, reducere prøvekrav, og øge udbyttet for at opnå en mere homogen EV prøve til brug i alle EV forskning. Denne metode er særlig nyttig i undersøgelsen af evt og deres indhold under virus infektion, da det omfatter et 0,22 μm filtreringstrin for at udelukke store, uønskede vesikler og Vlp’er og adskillelse af den samlede EV-population baseret på tæthed for effektivt at Isoler EVs fra virions.

Protocol

1. filtrering og udfældning af ekstracellulære vesikler (EVs) For at forberede kulturen supernatanten fra inficerede eller transficeret celler (dvs. cellelinjer og/eller primærceller), kultur ca 10 ml af sene-log celler i 5 dage ved 37 °c og 5% Co2 i passende kulturmedium (dvs., rpmi eller DMEM med 10% føtal kvæg serum [FBS]).Bemærk: Alle reagenser til kulturmedium skal være fri for EVs og kan enten købes (Se tabel over materialer) eller tilberedes in-Ho…

Representative Results

PEG nedbør øger EV udbytteVores kombination tilgang til EV isolation er betydeligt mere effektiv med hensyn til EV opsving i forhold til traditionelle ultracentrifugering, som det fremgår af 90% reduktion i mængden af udgangsmateriale, der kræves. Ultracentrifugering, den nuværende guld standard i EV isolation, kræver ca. 100 mL kultur supernatanten at producere en passende EV prep for downstream assays, mens vores roman protokol kræver kun 10 mL. Denne redukt…

Discussion

Den skitserede metode giver mulighed for forbedret EV-udbytte og adskillelse af virus fra EVs ved hjælp af en kombination tilgang til isolation. Relativt store mængder af udgangsmateriale (dvs. celle supernatant) kan filtreres før EV-isolation ved udfældning, GD separation og tilsætning af nanopartikel, hvilket resulterer i et endeligt volumen på ~ 30 μL, hvilket giver mulighed for umiddelbar brug i en række downstream-assays. Brugen af nanopartikel berigelse er afgørende, da disse EV-berigende nanopartikler i f…

Materials

CEM CD4+ Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS without Ca and Mg (1X)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Peak Serum	PS-FB3	Serum
HIV-1 infected U937 Cells	NIH AIDS Reagent Program	165	U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
Ultra-Clear Tube, 14x89mm	Beckman Coulter	344059