We beschrijven een methode voor de voorbereiding van de enkele vers geïsoleerde detrusor gladde spiercellen van menselijke urineblaas monsters gebruik maken van een twee-stap enzymatische procedure. De verkregen levensvatbare DSM-cellen kunnen worden bestudeerd door verschillende eencellige technieken, waaronder de beschreven amphotericine-B patch-clamp elektrofysiologie om fysiologische en farmacologische eigenschappen te onthullen.
Detrusor gladde spier (DSM) cellen aanwezig in de urineblaaswand uiteindelijk vergemakkelijken urineopslag en voiding. Voorbereiding van de levensvatbare, verse en geïsoleerde DSM-cellen vormt een belangrijke technische uitdaging waarvan de prestatie optimale cellen biedt voor latere functionele en moleculaire studies. De methode ontwikkeld en uitgewerkt hierin, met succes gebruikt door onze groep voor meer dan een decennium, beschrijft dissectie van menselijke urineblaas monsters verkregen uit open blaas operaties, gevolgd door een enzymatische twee-staps behandeling van DSM stukken en mechanische trituratie om vers geïsoleerde DSM cellen te verkrijgen. De eerste stap omvat dissectie om de DSM-laag (ook bekend als muscularis propria) te scheiden van slijmvlies (urothelium, lamina propria en muscleis mucosa) en de aangrenzende bind-, vaat- en vetweefsel aanwezig. De DSM wordt vervolgens in stukken gesneden (2-3 mm x 4-6 mm) in nominale Ca2+-bevattende dissectie/spijsverteringsoplossing (DS). DSM-stukken worden vervolgens overgedragen aan en achtereenvolgens afzonderlijk behandeld met DS die papaïne en collagenase bij ~37 °C voor 30-45 min per stap bevatten. Na wasbeurten met DS die enzymvrij runderserum en trituratie met een brandgepolijste pipet bevatten, geven de stukken enkele DSM-cellen af. Vers geïsoleerde DSM-cellen zijn bij uitstek geschikt voor fragment-klem elektrofysiologische en farmacologische karakteriseringen van ionenkanalen. Concreet laten we zien dat de TRPM4-kanaalblokker 9-fenanthrol de spanningsstap-ontluchtingsstromen vermindert die zijn geregistreerd met de geperforeerde patchklembenadering van amphotericin-B. DSM-cellen kunnen ook worden bestudeerd door andere technieken zoals eencellige RT-PCR, microarray analyse, immunocytochemie, in situ nabijheid sjaer, en Ca2 + beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van enkele DSM-cellen is dat de gemaakte waarnemingen rechtstreeks betrekking hebben op enkele celkenmerken die aan het licht kwamen. Studies van vers geïsoleerde menselijke DSM-cellen hebben belangrijke inzichten opgeleverd die de eigenschappen van verschillende ionenkanalen karakteriseren, waaronder kation-doorlaatbaar in de urineblaas en zullen doorgaan als een gouden standaard bij het verduidelijken van dsm cellulaire eigenschappen en regelgevende mechanismen.
Detrusor gladde spier (DSM) cellen vormen de meest voorkomende celtype in de urineblaas en uiteindelijk controle urine opslag en voiding door ontspanning en contractie, respectievelijk. DSM-cellen vormen vloeiende spierbundels die verstrengelen met aangrenzend bindweefsel, zenuwprocessen, interstitiële cellen en andere celtypen1. Het huidige begrip van de rol van DSM-cellen in de urineblaasfunctie is bereikt door middel van een geïntegreerde aanpak op meerdere niveaus. Elke experimentele methode – of het nu gaat om geïsoleerde enkelvoudige cellen in vitro, weefselstrips met gladde spierbundels in vitro/ex vivo, of in vivo bepalingen (zoals cytometrie en voiding function assessments) – biedt belangrijke en specifieke inzichten in fysiologische en farmacologische eigenschappen van DSM (zie beoordelingen1,2,3,4,5,6 voor details). De interpretatie van de resultaten die zijn verkregen uit geïsoleerde enkele cellen maakt het echter mogelijk conclusies specifiek toe te schrijven aan het eencellige type zelf. Deze realisatie is de drijvende kracht geweest voor het vaststellen van een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het verkrijgen van vers geïsoleerde DSM-cellen uit de gehele dikte urineblaasmonsters. In tegenstelling tot veel andere celtypen kunnen gladde spiercellen niet betrouwbaar worden gekweekt als gevolg van het verlies van hun inheemse fenotype, inclusief specifieke veranderingen in hun elektrofysiologische en contractiele eigenschappen7,8. Dit feit versterkt verder het belang van studies uitgevoerd op fysiologisch actieve vers geïsoleerde DSM cellen.
Eind jaren tachtig en begin jaren negentig publiceerde isenbergs groep (Duitsland) een reeks elektrofysiologische studies naar vers geïsoleerde DSM-cellen verkregen uit proefkonijnenurineblazen9,10,11,12,13 ( tabel1). De methode benadrukte twee belangrijke waarnemingen die hielpen bij het verkrijgen van vitale cellen en diende als een eerste richtlijn voor anderen te volgen. Ze waren 1) voorbehandeling van geïsoleerde DSM-stukken met Ca2+-vrije oplossing/medium voorafgaand aan enzymatische behandeling en 2) weefselvertering met een oplossing die collageen ase bevat. Deze twee kritieke stappen zijn opgenomen in alle volgende varianten van DSM-celdissociatieprocedures(tabel 1). Momenteel, onze groep maakt gebruik van een twee-stap sequentiële papaïne-collageen dissociatie aanpak. DSM-stukken worden eerst behandeld met een enzymoplossing die papaïne bevat en vervolgens met collageentype II in dezelfde oplossing (DS, dissectie/spijsverteringsoplossing). Deze aanpak levert enkele DSM-cellen op van verschillende soorten, waaronder cavia, varken, rat, muis en vooral menselijk(tabel 1).
Enkele DSM-cellen vormen een bron voor meerdere moleculaire biologie en fysiologische experimenten. Tot nu toe bestudeerden eiwit- en mRNA-uitdrukkingen met immunocytochemie, of RT-PCR/qRT-PCR-bepalingen onthulden hoge detectieniveaus voor verschillende ionenkanalen, waaronder de grote geleidingsspanning- en Ca2+-geactiveerd (BK), kleine geleiding Ca2+-geactiveerde K+ type 3 (SK 3), voltage-gated K+ (Kv),L-type voltage-gated Ca2+ (Cav), en voorbijgaande receptor potentiële melastatine type 4 (TRPM4) kanalen, evenals een Na/Ca2+ wisselaar 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Ze zijn allemaal gedacht aan DSM excitability controle, intracellulaire Ca2 + niveaus en contractility. Patch-clamp elektrofysiologische benaderingen, rechtstreeks uitgevoerd op cavia-, muis-, ratten- of menselijke DSM-cellen, gaven directe demonstratie van biofysische en farmacologische eigenschappen van L-type Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK en TRPM4 kanalen17,19,20,21,22,23,24, 25,25 ,26,27,28,29,30,31. De benaderingen omvatten een conventionele spanningsklem voor hele cellen, een geperforeerde spanningsklem en single-channel opnames (celbevestigd, binnenstebuiten- en buiten-outconfiguraties). Bovendien, membraan potentiële opname van DSM met behulp van een stroom-klem geleverd bewijs dat target-boeiende farmacologische middelen veranderen de cel prikkelbaarheid. Zo veroorzaakte de TRPM4-remmer 9-fenanthrol hyperpolarisatie in DSM-cellen verkregen van mensen, cavia en urineblazen van ratten19,20,22,31. Onder de verschillende elektrofysiologische methoden, de amphotericine-B (en nystatine, gramicicidive, en β-escin) geperforeerde patch-klem opnames bieden een belangrijk voordeel door het behoud van intrinsieke intracellulaire signalering moleculen en paden. Alleen lage moleculaire gewichtskationen en in mindere mate, Cl– – maar niet eiwitten of signaalmoleculen waaronder Ca2 + – zijn doorlaatbaar door de plasma membraan poriën gevormd door amphotericine-B of nystatine32. Het succesvolle resultaat van geperforeerde patch-clamp experimenten hangt af van verschillende algemene variabelen die uniek zijn voor deze techniek. Hier beschrijven we de details van de procedure met behulp van amphotericin-B die onze groep in de loop der jaren15,22,33,34,35,36,37,38,39heeft gebruikt .
Ongetwijfeld blijven niet-selectieve kationkanalen een van de minst begrepen kanaaltypen in DSM-cellen. Het eerste verslag van een niet-selectief kation-achtig kanaal dateert uit 1993. Het papier van Wellner en Isenberg11 beschreef een 33 pS stretch-geactiveerd enkelkanaal met de volgende rangvolgorde van ionendoorlaatbaarheid: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, en remming van kanaalactiviteit door Gd3+, een algemene remmer van niet-selectieve kationkanalen. Bijna tien jaar later beschreven Thorneloe en Nelson40 Na+ permeabele kationstromen in dsm-cellen van muizen, geremd door Gd3+,met behulp van whole-cell opnames. Aangezien moleculaire identiteiten van niet-selectieve kationkanalen en hun biofysische karakteriseringen nog moeten worden bepaald, zijn toekomstige onderzoeken op dit onderzoeksgebied gerechtvaardigd. Het hierbeschreven protocol voor de registratie van niet-selectieve kationkanaalstromen – met behulp van extracellulaire en pipet intracellulaire oplossingen die Cs+, TEA+en nifedipine(tabel 2) bevatten die de Kv- en Cav-stromen fysiologisch en farmacaal verzachten – is en zal nuttig blijven bij elektrofysiologische onderzoeken naar niet-selectieve katiekanalen. We hebben dit specifieke protocol gebruikt om de mate van remming van de hele cel kation stromen door de TRPM4 kanaal blokker 9-fenanthrol in cavia, rat en menselijke DSM cellen19,20,22.
Samen, de methode hier beschreven voor het verkrijgen van vers geïsoleerde enkele DSM cellen uit menselijke urineblaas biedt levensvatbare cellen zeer geschikt voor elektrofysiologische onderzoeken met behulp van verschillende configuraties van de patch-clamp techniek, Ca2 +-imaging, immunocytochemie, in situ proximale litigation test, en eencellige RT-PCR / qRT-PCR evenals geavanceerde moleculaire biologie technieken met inbegrip van microarray analyse, RNA-seq, en CHIP-seq. Het gebruik van de geperforeerde patchklemmethode met amphotericin-B behoudt de oorspronkelijke celomgeving in tegenstelling tot andere configuraties. Wanneer uitgevoerd met behulp van de specifieke voorwaarden die hier worden beschreven, ontworpen om bijdragen van K+ en Ca2+ stromen in DSM-cellen te ontkennen, tonen spanningsstap-geïnduceerde stromen de eigenschappen van niet-selectieve kationstromen die geschikt zijn voor biofysische en farmacologische karakteriseringen.
De hier beschreven procedures verklaren de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van levensvatbare, vers geïsoleerde DSM-cellen uit menselijke urineblaasmonsters met hele dikte met behulp van enzymatische spijsvertering en bij de registratie van hele celkationstromen die gevoelig zijn voor de TRPM4-kanaalremmer 9-fenanthrol met behulp van de geperforeerde patchklembenadering van amphotericin-B. De enzymatische procedure is gebaseerd op een sequentiële blootstelling in twee stappen die hierin wordt aangeduid als de sequentiële papain-collagenase vergistingsmethode. DSM weefsels worden eerst behandeld met papaïne en dithiothreitol (een enzym stabiliserende agent) onder een nominale Ca2 +-vrije toestand, gevolgd in de tweede stap door collagenase type II in aanwezigheid van lage Ca2 +. De reden voor het uitvoeren van papaïne spijsvertering onder lage Ca2 + voorwaarden in gladde spiercellen dateert uit de late jaren 1980. Vers geïsoleerde halsslagader gladde spiercellen bereid met papaïne weergegeven een langwerpige vorm, toonde levensvatbaarheid (weerstand tegen Trypan Blue opname) en reageerde op contractiele stimuli (hogere Ca2 + en histamine)65. Jaren later werd deze methode toegepast bij de bereiding van DSM-cellen (zie tabel 1). De keuze van collageen type II in plaats van andere soorten heeft betrekking op de relatief hoge proteolytische activiteit bij uitstek geschikt voor gladde spierweefsels, waaronder DSM. De behandeling van collageen kan immers alleen maar enkele DSM-cellen opleveren, zij het dat uitgebreide enzymblootstelling (≥60 min)53,54vereist. Aangezien collageenactiviteit afhankelijk is van Ca2+ en het enzym inactief is onder de Ca2+-vrije omstandigheden, vereist een optimale enzymatische vertering van DSM-stukken de aanwezigheid van Ca2+ 66. In ons geval bevat DS-C 100-200 μM [Ca2+] (Tabel 2). Na enzymatische behandeling worden verteerde DSM-stukken een aantal keren voorzichtig gewassen met koude DS zonder enzymen of Ca2+ om een enzym gebonden aan weefsels te verwijderen. De ijskoude DS helpt de dsm-celintegriteit te behouden en enzymatische activiteit van een resterende papaïne of collageenase te beperken. In de laatste stap, trituratie van enzym-behandelde DSM stukken met een brand gepolijst Pasteur pipet releases enkele DSM cel. DSM-cellen worden onmiddellijk op een opnamekamer geplaatst voor patch-clamp studies of andere soorten experimenten of opgeslagen op ijs in DS voor gebruik later op dezelfde dag (meestal binnen 8 uur na de voorbereiding, maar de cellen blijven levensvatbaar voor maximaal 24 uur).
We hebben een aantal belangrijke overwegingen geïdentificeerd voor het succesvol verkrijgen van enkele DSM-cellen. De eerste heeft betrekking op de menselijke DSM specimen bron kwaliteit. Om de weefselintegriteit optimaal te bewaren, worden DSM-monsters die zijn verkregen uit open blaasoperaties zo snel mogelijk in ijskoude DS geplaatst en in een koude omgeving onderhouden. Met name bij chirurgische extractie van de patiënt wordt het blaasmonster onmiddellijk op een volledig voorbereide bijzettafel in de operatiekamer geplaatst. Bruto onderzoek van het hele monster (meestal verkregen tijdens radicale of eenvoudige cystectomie) en de opening volgen. Na visuele inspectie wordt een stuk van hele dikte urineladder specimen verwijderd uit een afgelegen gebied van het monster schromelijk niet betrokken bij tumor en onmiddellijk geplaatst in een beker (50 of 100 mL) met koude (~ 4 °C) Dissectie Solution (DS) (Tabel 2) en vervolgens stevig gesloten met een deksel. Vanwege de geplande aard van de oogst van het weefsel worden het personeel van de operatiekamer en het hulppersoneel dat de oogst uitvoert aan het begin van de chirurgische zaak gewaarschuwd om de materialen beschikbaar te hebben in de operatiekamer op het moment van weefselextractie. Deze voorzorgsmaatregelen samen met de routine, repetitieve aard van de verwerking stappen houden de warme ischemie tijd voor het weefsel – van extractie tot plaatsing in de gekoelde container met DS-oplossing – tot minder dan 5 min. De container wordt vervolgens in een koelkast of op ijs in een koeler geplaatst om de koude omgeving te behouden en (ijskoud) naar het laboratorium te vervoeren. Zodra het monster in het laboratorium aankomt, beginnen dissectie en enzymatische dissociatiestappen. Het is zeer moeilijk te voorspellen of een bepaald DSM-exemplaar DSM-cellen van hoge kwaliteit zal opleveren na enzymatische dissociatie, dus gaan we verder met de enzymatische dissociatiestappen. In veel gevallen voert onze groep, parallel aan elektrofysiologische experimenten, isometrische spanningsopnamen uit op DSM-strips die zijn opgesteld uit dezelfde DSM-exemplaren. We hebben ontdekt dat we meestal dsm-cellen van hoge kwaliteit kunnen verkrijgen uit preparaten die ook met succes levensvatbare strips leveren voor isometrische contractiestudies (onze ongepubliceerde observatie).
De tweede factor heeft betrekking op verschillende enzymlotvariabiliteiten. We merkten op dat voor zowel papaïne als collageen type II, telkens wanneer er een nieuw enzym van een leverancier aankomt, de enzymactiviteit in DS voor weefselvertering kan variëren. Wij optimaliseren daarom routinematig de enzymconcentratie en incubatieintervallen voor elke nieuwe partij. Om de bijdrage van de partijvariabiliteit te minimaliseren, bestellen we grotere hoeveelheden van dezelfde partij en maken we een grote partij voorraadoplossingen in 2 mL aliquots enzymen en slaan ze op ~-20 °C tot het gebruik. Na verloop van tijd kunnen bevroren voorraden (opgeslagen tot 2 weken) echter hun enzymatische activiteit verliezen. De derde variabele heeft betrekking op de temperatuur van enzymspijsverteringsbehandelingen. Enzymatische activiteiten van zowel papaïne als collageen ase tonen temperatuurafhankelijkheid. Papaïne en collageen type II vertonen activiteit in de temperatuurbereiken die de normale lichaamsfysiologieomvatten 67,68. Daarom streven we ernaar om de enzymbehandelingen stabiel te houden bij ~ 37 °C om hogere temperaturen te vermijden om de dsm-celintegriteit te behouden. De vierde overweging betreft de variabiliteit van de kwaliteit van DSM-cellen die aanwezig zijn in elk preparaat, variërend van zeer levensvatbaar (vertonen uitstekende klassieke gladde spierkenmerken) tot niet-gezonde, oververteerde cellen. Een langdurig enzym incubatieinterval is een van de belangrijkste redenen voor het verkrijgen van een hoog aantal beschadigde cellen. Overmatige enzymbehandelingen schaden ook de eiwitstructuren van ionenkanalen, receptoren en transporters, die hun functionaliteit negatief beïnvloeden. Interpretatie van de resultaten verkregen uit enzymatisch verkregen, vers geïsoleerde cellen moet rekening houden met deze overweging. Optimalisatie van enzymvertering voorwaarden is gericht op het verhogen van het percentage van zeer levensvatbare cellen. Experimentele benaderingen die afhankelijk zijn van een hoger aantal levensvatbare cellen, zoals microarray-analyses, vereisen robuustere optimalisaties dan die met succes worden uitgevoerd op minder cellen, zoals eencellige patch-clamp elektrofysiologie of Ca2+ beeldvorming. De aandacht voor de bovengenoemde factoren heeft onze onderzoeksinspanningen in de afgelopen tien jaar geleid bij het verkrijgen van hoogwaardige enkele DSM-cellen.
De geperforeerde patch-klem techniek is al meer dan een kwart eeuw een steunpilaar elektrofysiologische benadering. Verschillende publicaties geven details over de technische overwegingen69,70,71,72,73. Celperforatie kan worden verkregen met amphotericine-B, nystatine, gramicidine of β-escine (zie referentie32voor overzicht van elk). Het belangrijkste voordeel van geperforeerde patch-klem opnames over andere elektrofysiologische benaderingen is dat de inheemse intracellulaire omgeving – met inbegrip van intracellulaire Ca2+en signaalmoleculen (bijvoorbeeld cAMP, PKA, fosfaten en fosfodiesterases) – worden bewaard. Deze techniek is dus bij uitstek geschikt voor het onderzoeken van hele cel ionenkanaalstromen en hun regulerende mechanismen onder bijna fysiologische omstandigheden. Een belangrijk voorbehoud is dat intracellulaire celsamenstelling niet precies kan worden gecontroleerd in tegenstelling tot andere elektrofysiologische methoden zoals conventionele whole-cell en single-channel excised-patch (binnen- en buiten-out) opnames. In onze ervaring dragen drie factoren routinematig bij aan succesvolle experimentele resultaten van geamputeerde patch-clamp experimenten. De eerste is de kwaliteit van de DSM-cel die is gekozen om een opname te proberen. Wanneer DSM-cellen zeer levensvatbaar zijn met een semi-contractiele (serpentine-achtige), hoog contrast glanzende verschijning met een goed gedefinieerde halo rond het celoppervlak en hechten strak aan de glazen bodem van de opnamekamer dan giga-seal vorming en cel perforatie optreden relatief eenvoudig. De tweede en derde factoren voor succes hebben respectievelijk betrekking op de kwaliteit van de bron en de oplosbaarheid van amphotericine-B (in dimethylsulfoxide/DMSO en intracellulaire pipetoplossing). We constateerden verschillen tussen verschillende leveranciers in termen van bron- en lotvariabiliteit. Elke dag bereiden we een nieuwe oplossing van amphotericine-B voorraad oplossing uit poeder, gevolgd door de verdunning in intracellulaire pipet oplossing. Deze stappen vereisen uitgebreide sonicatie en vortexing. Met vers gemaakte amphotericine-B-bevattende pipetoplossing, succesvolle celperforatie (+Ca2+, en niet-selectieve kationstromen uit menselijke, cavia’s, muizen- en/of ratten-DSM-cellen17,21,22,23,29,30,31,35,60. Hier beschrijven we voorwaarden voor het registreren van niet-selectieve kationstromen in menselijke DSM-cellen. 9-Phenanthrol, een blokker van TRPM4 kanalen, verzwakte spanning-stap geïnduceerde stromen ter ondersteuning van de rol van deze kanalen in de controle van DSM prikkelbaarheid. Als opmerking, het vereist meestal ten minste 45 min na het verkrijgen van een giga-afdichting en initiatie van perforatie om een optimale stabiele spanning-stap geïnduceerde niet-selectieve kation stromen record. Spanningshellingen kunnen ook worden gebruikt als alternatief voor voltage-step protocollen30,64. Hier, een voltage-step protocol van een hypergepolariseerde bedrijf membraan potentieel werd de voorkeur in plaats van een helling protocol, omdat de voormalige aanpak minimaliseert het effect van spanning-afhankelijke inactivering en zorgt voor het gemiddelde van opgeroepen stroom over een duur van een spanningsstap waarbij de helling een enkel gegevenspunt per spanning biedt. Dit laatste punt geldt vooral voor menselijke DSM-cellen, omdat de stromen variabele activiteit vertonen tijdens spanningsstappen (Figuur 5EnFiguur 6). De geperforeerde patchklemtechniek van amphotericin-B is essentieel geweest bij het identificeren van de eigenschappen van DSM-cellen en andere celtypen en zal blijven helpen bij het bieden van nieuwe ontdekkingen in de toekomst. Bovendien kunnen vers geïsoleerde enkele DSM-cellen met succes worden gebruikt voor het meten van+Cl–, en Ca2+stromen met de conventionele modus van de patch-clamp techniek, membraan potentiële opname met de huidige klem, en single channel opnames zoals geïllustreerd door onze eerdere rapporten23,29,35,64.
Naast single cell patch-clamp methoden, vers geïsoleerde DSM cellen kunnen worden bestudeerd met andere technische benaderingen, waaronder Ca2 + imaging, RT-PCR/q-RT-PCR, immunocytochemie, in situ nabijheid ligatie test, en genomische benaderingen (bijvoorbeeld microarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Aangezien single cell transcriptome bepalingsmethoden blijven evolueren en zeer gevoelig worden, zien we ons in een toekomstige mogelijkheid om routinematig en specifiek elektrische of farmacologische eigenschappen van individuele DSM-cellen te koppelen aan hun transcriptoom/proteomeprofielen. Dit zal worden bereikt door eerst opname uit een DSM-cel en vervolgens het extraheren van mRNA of eiwit, gevolgd door transcriptomische / proteomische analyses. Hoewel dergelijke methoden al in niet-DSM-cellen zijn getest, zijn ze momenteel technisch uitdagend, gebrek aan gevoeligheid om als routine te worden beschouwd en beperkt tot een succesvolle detectie van een paar geselecteerde genproducten74. Functie-moleculaire profielexpressie koppelen studies wanneer gedaan op DSM cellen verkregen uit urineblazen afgeleid van controle en zieke patiënt-donoren zal inzicht geven in fysiologische processen die essentieel zijn voor het besturen van normale DSM-functies, pathogenese, en bij het identificeren van effectieve nieuwe therapeutische benaderingen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH-R01DK106964 en P20DK123971 subsidies aan Georgi V. Petkov. De auteurs danken Dr Viktor Yarotskyy en Mevrouw Sarah Maxwell voor kritische evaluatie van het manuscript. We zijn ook dankbaar voor urologie staf chirurgen bij MUSC en UTHSC: Drs. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter, en Anthony Patterson evenals de MUSC en UTHSC Urologie bewoners: Drs. Taylor Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O’Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata voor hun hulp bij menselijke weefselinzameling.
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |